米糠黄酮的提取及其抗癌活性初步研究

刘剑利 刘 丹 王 帅 唐志鹏 贺 音 曹向宇

(辽宁大学生命科学院，沈阳 110036)

米糠是稻谷加工的副产品，约占稻谷产量5.0% ～5.5%，年产近 1 000万 t，是一种产量大、综合利用价值不高的农副产品［1］。在我国，米糠大部分用于畜禽饲料使用，有效成分利用率不足20%［2］。近年来，研究发现米糠中包含丰富的活性成分，包括低过敏性的米糠蛋白［3］;降低人体血清胆固醇的米糠油［4］;增强免疫力的米糠多糖［5］;米糠中含有15% ～23%脂肪、14% ～16%蛋白质、25% ～40%膳食纤维，还含有大量γ－谷维素(3.86～5.89 mg/g)、多酚(9.60 ～81.85 mg GAE/g)、维生素 E(0.32 ～0.44 mg/g)等生理活性物质［6］。研究表明:米糠中含有花青素、柚皮素和槲皮素等黄酮类化合物，具有较强的生物活性，如显著的抗氧化、抗衰老等功能［7］，而关于米糠黄酮抗肺癌的研究鲜有报道。开发和利用米糠黄酮既有利于资源的循环利用，又能产生一定的经济收益，为人类健康和疾病预防提供一种明确生物活性的天然物质。

黄酮类化合物比较常用的制备方法包括有机溶剂提取、碱性水提、超临界萃取等，水浸提的弊端在于粗品中含有很多不纯成分，得率偏低;碱提浸出效果好，但杂质多，给后期纯化带来不便;超临界CO2萃取技术具有得率高、无残留溶剂、无污染的优点，但是所需设备价格昂贵、生产成本高［8］。目前，米糠黄酮最常用的提取方法为有机溶剂提取，黄酮提取率不高［9］。因此寻求生产成本较低的、黄酮得率高的方法，对于黄酮开发具有重要意义。超声波法利用超声波动形式破坏组织，促进溶剂的穿透作用，提高有效成分的得率［10］。酶解法通过降解植物细胞壁，促进胞内有效成分溶出，较温和的将组织分解，确保提取物的性质稳定，既能缩短所用时间，又能提高得率［11］。本研究拟采用响应面法优化超声辅助酶法提取米糠黄酮工艺，进一步研究米糠黄酮对人肺癌细胞(A549)的作用，以期为米糠资源的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米糠，沈星1号:沈阳市北星水稻研究所;人非小细胞肺癌细胞A549:中国医科大学，实验室液氮保存;芦丁(纯度﹥95%)、纤维素酶(酶活力U/g≥1.5×104)、二甲基亚砜(DMSO):国药集团化学试剂有限公司;3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴盐(MTT):Sigma公司;RPMI－1640培养基(Hyclone)、青链霉素双抗、胰蛋白酶:北京鼎国生物技术有限责任公司;Hochest33258:南京凯基生物科技。

1.2 主要仪器设备

UV－2700紫外分光光度计:岛津企业管理(中国)有限公司;SCIENTZ－IID超声波细胞粉碎机:宁波新芝生物科技股份有限公司;SCIENTZ－10N型真空冷冻干燥机:宁波新芝生物科技股份有限公司;RE－52CS－2型旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;Multiskan FC型酶标仪:赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;HERACELL 150i二氧化碳培养箱:北京昊诺斯科技有限公司;Nikon(MODEL C－SHG1)荧光显微镜:尼康仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黄酮得率的测定

参照关海宁等［12］方法，制作芦丁标准曲线。根据标准曲线，计算出提取液中黄酮的质量浓度，通过公式得出米糠黄酮得率。

式中:C为标准曲线计算出测定样液的质量浓度/mg/mL;V为测定吸光度时样液的体积/mL;N为提取液总体积/测定吸光度移取样液的体积;M为米糠质量/mg。

1.3.2 单因素实验

米糠经粉粹机粉碎，过60目筛制成粉末备用。称取1 g米糠粉末，置于小烧杯中，固定其他实验条件(蒸馏水20 mL，水浴温度50℃，酶解时间2 h，pH 5)，进行酶解反应，酶解结束后，离心取上清，余下沉淀进行超声处理，超声后离心取上清，合并上清液测得率。以米糠黄酮的得率为指标，分别考察超声辅助酶法提取米糠黄酮的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、加酶量(60、90、120、150、180 U/g)、乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%)、超声时间(10、20、30、40、50 min)4 个因素对米糠黄酮得率的影响，每组实验做3个平行。

1.3.3 Box－Behnken实验设计

以米糠黄酮得率为响应值，根据单因素实验结果，选择对米糠黄酮影响显著的4个因素，采取4因素3水平的组合设计，筛选制备米糠黄酮的最佳工艺条件。

表1 Box－Benhnken实验设计水平

1.3.4 米糠黄酮抗肺癌活性的测定

细胞培养条件:A549细胞系常规培养于RPMI 1640培养液中，内含10%胎牛血清，1%双抗(青霉素100 U/mL，链霉素100μg/mL)，待细胞生长密度达到80% ～90% 时，按照1∶3比例传代，37℃、5%CO2培养箱培养至细胞处于对数生长期即可用于实验。实验中米糠黄酮提取液经冷冻干燥后得到粉末，采用A549细胞的培养基将其溶解，细胞处理所用黄酮液的添加量为总体积的4.76%，未对细胞培养体系形成实质性改变。

1.3.4.1 米糠黄酮对A549细胞损伤的形态学观察

A549细胞以每孔4×105个接种到6孔板内，每孔培养液体积2 mL，置于37℃ 5%的CO2培养箱中培养24 h，然后设置正常对照组、实验组(米糠黄酮质量浓度 20、40、80 mg/mL)，共同培养 24 h，在显微镜下观察细胞形态。

1.3.4.2 米糠黄酮对A549细胞增殖情况影响

A549细胞以每孔3×103个接种到96孔板内，每孔培养液体积200μL，细胞培养方法及各剂量组浓度同 1.3.4.1，MTT 法检测细胞活力。

1.3.4.3 米糠黄酮对A549细胞凋亡水平影响

处理好的盖玻片置于12孔板中，将A549细胞以每孔8×104个接种到12孔板内，每孔培养液体积1 mL，细胞培养方法及各剂量组浓度同 1.3.4.1，24 h后去除培养基，加入4%多聚甲醛室温固定30 min后，去固定液并清洗，向盖玻片上滴加100μL Hoechst33258工作液，染色后于荧光显微镜下观察，计算凋亡率。

1.4 数据分析

实验重复3次，结果取平均值，数据采用SPSS 20.0进行方差分析，比较组间差异。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

如图1所示，黄酮含量与其在510 nm处的吸光度值呈良好的相关性，其中R2=0.999 2，根据公式y=10.97x+0.058 2可计算出提取液中黄酮含量。

2.2 单因素实验结果

根据图2可知，料液比在1∶10～1∶20 g/mL的范围内，米糠黄酮的得率呈现不断上升趋势，当料液比为1∶20 g/mL时，米糠黄酮得率最高，当料液比比值持续变大时，米糠黄酮的得率逐渐减小。这可能是因为液料比为1∶20 g/mL时，黄酮类物质已基本溶出，继续增加溶剂用量反而会促使其他杂质的溶出，使得黄酮得率下降［13］。考虑到节约成本以及后续回收操作，因此选择1∶20为最佳料液比。加酶量在60～180 U/g的区间内，米糠黄酮的得率呈现先上升后平缓趋势，在120 U/g时，得率最高;继续增大加酶量，黄酮得率变化不大。原因是加酶量不足导致细胞壁没有充分溶解，细胞内含物质释放不完全，导致得率低。当加酶量足够时，细胞壁被充分降解，黄酮从细胞中被释放出来，提高得率。但当加酶量继续增大时，米糠黄酮的得率没有继续上升，原因可能是溶液中的酶添加量已接近饱和，继续增加酶用量，对得率作用不大。从降低成本、节约能源角度考虑，加酶量为120 U/g时最佳。

图1 芦丁标准曲线

2.3 响应面实验结果

图2 不同因素对米糠黄酮得率的影响

如图2所示，一定范围内，当乙醇体积分数持续提高，米糠黄酮的得率呈现上升趋势，在乙醇体积分数为60%时，得率最高。随着乙醇体积分数由60%不断加大到80%，米糠黄酮的得率不断减小。这是由于乙醇体积分数变大，会增加其他醇溶性物质的溶出量，使黄酮类物质的得率呈现下降趋势［13］。综合来看，乙醇体积分数控制在60%左右为宜。超声时间在10～20 min的范围内，米糠黄酮的得率逐渐提高，在超声时间到达20 min时，米糠黄酮得率最高。但当超声时间继续提高，米糠黄酮的得率呈现减小趋势。可能是由于超声过程中机械效应和热效应不断上升，对黄酮类物质产生破坏。由此可知20 min为最佳超声时间。

采用 Design－Expert 7.0软件中的 Box－Behnken程序进行实验设计。结果见表2，根据表2数据进行分析得出以米糠黄酮得率为响应值的回归方程为:

表2 Box－Benhnken实验设计结果

2.4 回归模型方差分析

由表3 可知，一次项 A、B、C、D 和二次项 A2、B2、C2、D2对米糠黄酮得率的作用均达到了极显著水平;模型(P＜0.000 1)极显著，失拟项(P=0.054 8＞0.05)不显著，说明模型成立。方程相关系数R2=0.969 7，校准决定系数 R2Adj=0.939 4，变异系数CV%=1.2，说明模型与实际拟合程度好，能较好地反映米糠黄酮得率与各因素之间的关系，由影响因素的F值可以判断各因素对得率的影响顺序为:B＞A＞C＞D。

表3 响应面实验回归模型方差分析

2.5 双因素交互作用分析

通过Box－Behnken实验得出各实验因子对米糠黄酮得率变化的交互作用，确定各因素的最优影响范围。料液比在1∶18～20 g/mL范围，酶用量在120～126 U/g范围，乙醇体积分数在59% ～61%之间，最适的超声时间在18～20 min之间对黄酮得率最佳。其中，影响米糠黄酮得率最显著的因素为加酶量，其他因素次之，各项单因素对应的P值均小于0.01，皆达到极显著水平。

2.6 验证实验结果

利用Design－Expert 7.0软件得到预测的米糠黄酮最佳提取工艺为:料液比1∶18.82 g/mL、酶用量124.69 U/g、乙醇体积分数 60.49%、超声时间 18.97 min，在此条件下黄酮的理论得率为0.524%。考虑到实际操作中遇到问题，将此工艺修整为:料液比1∶19 g/mL、酶活力125 U/g、乙醇体积分数 60%、超声时间19 min，并进行3次验证实验，得出黄酮得率为0.52%，与预测值基本吻合，说明模型能较好预测米糠中黄酮得率，优化工艺条件较可靠。

2.7 米糠黄酮对人肺癌细胞损伤的形态学观察结果

从图3可以看出，对照组细胞形状匀称，贴壁较好，棱角清晰。随着米糠黄酮浓度的增加，细胞贴壁数目逐渐减少，边缘模糊，折光性减弱，其中80 mg/mL米糠黄酮组细胞明显变圆收缩，凋亡特征明显，说明米糠黄酮对肺癌A549细胞具有抑制作用，并且呈现量效关系。刘盛楠等［14］选取白藜芦醇诱导肺癌A549细胞，细胞形态与本实验的结果。

图3 米糠黄酮对A549贴壁细胞数的影响(100×)

2.8 米糠黄酮对人肺癌细胞增值情况的影响

由图4所示，米糠黄酮能够有效抑制A549细胞的生长，并且随米糠黄酮剂量的升高，对细胞抑制效果增强。当质量浓度上升到80 mg/mL时，细胞存活率变为(42.6±0.13)%，与对照组相比差异极显著(P＜0.01)，对A549细胞的生长抑制作用明显。李富华等［15］实验表明苦荞麸皮黄酮在实验质量浓度范围内，能显著抑制HepG2细胞增殖且表现出量效关系，与米糠黄酮效果类似。

图4 米糠黄酮对A549细胞增殖的影响

2.9 米糠黄酮对A549细胞的Hoechst33258实验结果

Hoechst33258是一种荧光蓝色染料，用于细胞凋亡检测。本实验通过Hoechst33258染料检测不同浓度的米糠黄酮诱导A549细胞凋亡的能力。对照组细胞显现均匀且较弱的蓝色荧光，与对照组相比，当米糠黄酮处理组浓度提高时，细胞核皱缩的数量上升，出现明亮的蓝色荧光斑块，即凋亡细胞数量上升，与对照组比较，差异极显著;而且随着米糠黄酮处理浓度的升高，细胞的数量逐渐减少，与对照组比较，差异极显著(P＜0.01)。结果表明，米糠黄酮可以有效的诱导人肺癌A549细胞的凋亡。钟良瑞等［16］实验证明经三叶青黄酮处理的A549细胞通过Hoechst 33258染色后细胞出现形态学改变，凋亡细胞的细胞核颜色变亮，出现增强的蓝色荧光，与米糠黄酮效果相近。

图5 荧光显微镜下观察A549细胞Hoechst33258实验结果(200×)

3 结论

通过单因素和响应面实验对影响米糠黄酮制备的4个因素进行探究，得出提取的最佳工艺条件为:料液比1∶19 g/mL、加酶量125 U/g、乙醇体积分数60%、超声时间19 min，得出米糠黄酮得率为0.52%。通过细胞形态学观察、MTT细胞活力检测及Hoechst33258细胞凋亡实验均显示米糠黄酮对A549细胞具有一定的生长抑制作用，说明制备的米糠黄酮具有一定抗癌活性，但其机制还有待进一步研究。