响应面法优化油茶粕培养里氏木霉酶系活力条件及发酵工艺研究

陈晓媛 于 达 朱 凯 宋广磊

(浙江工商大学食品与生物工程学院，杭州 310018)

自然界中的细菌、真菌和放线菌等微生物均能产纤维素酶降解纤维素，但里氏木霉因其产酶量高、易于培养控制及其代谢物安全无毒，被认为是产纤维素酶的良好菌株，对纤维素原料具有较高的降解力［1－2］。里氏木霉生产的纤维素酶具有重要的应用价值，在提取植物材料生物活性化合物中显示出巨大的潜力，也可用于纤维素类生物乙醇和其他生物能源的生产［3］;在果蔬业上，利用纤维素酶水解可溶性果胶和细胞壁［4］;在酿酒业上，促进释放葡萄糖，改善啤酒的质感;另外在农业、医药业、饲料工业［5－7］等方面都有所应用。

油茶粕是油茶籽经过提取油脂后的残渣，是一种富含多种营养成分的副产品。油茶粕营养丰富，主要含脂肪、蛋白质、多糖、茶皂素、粗纤维等物质，其中粗脂肪为5% ～8%，粗蛋白为12% ～18%，糖类物质为30% ～60%，茶皂素为10% ～14%，粗纤维为5% ～8%［8］。油茶粕主要被应用于饲料的开发［9－10］，在水产养殖中作为清塘剂［11］，还用于生产沼气［12］。近几年，研究者们分析制备油茶粕中的茶皂素［13－14］、蛋白质［15－16］、多糖［17－18］等多种活性成分，不仅提高了油茶粕的利用率，同时也产生了一定程度的经济价值和生态效益。但是对油茶粕纤维素鲜有研究，油茶粕的开发层次仍然较低，其价值还没有得到充分利用。

本研究以油茶粕为原料，选择油茶粕比例、微晶纤维素添加量、接种量和初始pH为研究因素，测定不同发酵条件下纤维素酶活力，并以微晶纤维素作为酶系诱导底物，比较培养条件对里氏木霉纤维素酶的影响，在单因素的基础上，通过响应面分析，优化以油茶粕为底物的里氏木霉发酵制备可溶性膳食纤维的工艺条件，探索酶系活力与发酵条件的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

里氏木霉(Trichodermareesei):中国工业微生物菌种保藏管理中心，命名为Trichodermareesei CICC;油茶粕;纤维二糖;微晶纤维素;乙醇、羧甲基纤维素钠、酒石酸钠、3，5－二硝基水杨酸、硫酸铵、磷酸二氢钾、亚硫酸钠均为分析纯。

1.2 仪器与设备

303系列电热恒温培养箱;SHZ－82A水浴恒温振荡器;BOXUN立式压力蒸气灭菌器;DK－S24电热恒温水浴锅;XM－800Y多功能小型粉碎机;SWCJ－1D洁净工作台;KQ－80TDB超声波清洗器;TG18KR离心机;UV－2550紫外分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 油茶粕的预处理

将油茶粕烘干后，用粉碎机进行粉碎，以1∶9的比例加入80%乙醇，90℃水浴4 h，为脱除油茶粕中的抗营养因子茶皂素，不断搅拌最大程度脱除油茶粕中的茶皂素。水浴后冷却至室温，抽滤取滤渣并烘干，冷藏于冰箱备用。

1.3.2 培养基的配制

PDA培养基的配制:称取洗净去皮后的马铃薯200 g，切成约1 cm3的小块，于沸水浴30 min，用纱布过滤，加入15 g琼脂，加热搅拌均匀。待琼脂完全溶解后，加入20 g葡萄糖，搅拌均匀，加蒸馏水至1 000 mL。分装，121℃灭菌30 min，备用。

液体培养基的配制:葡萄糖20 g，硫酸铵5 g，磷酸二氢钾15 g，硫酸镁0.6 g，氯化钙0.6 g，硫酸亚铁0.005 g，加蒸馏水至1 000 mL。分装，121℃灭菌30 min，备用。

1.3.3 菌株的活化

取里氏木霉(Trichodermareesei CICC)菌株的冻干管，用接种环蘸取少量菌株冻干粉，于液体培养基中，30℃、200 r/min摇床震荡培养72 h。蘸取少量菌液，划线涂布于PDA固体培养基平板上，30℃，培养72 h。按上述方法重复2次，液体转平板，完成菌株活化。

1.3.4 菌悬液的制备

将PDA固体培养基上长势较好的绿色菌落移接到液体培养基中，于30℃、130 r/min摇床中振荡培养3 d。每隔2 h在549 nm条件下测量菌液的紫外吸光值。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制菌体生长曲线。培养至对数生长期后，用血球计数板进行计数，镜检稀释至适宜浓度，以108cfu/mL为宜。

1.3.5 单因素试验

1.3.5.1 油茶粕比例对发酵的影响

根据预实验，初步确定油茶粕添加比例为:2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%，微晶纤维素添加量为1.0%，接种量为12.0%，pH值为5.0，于30℃、130 r/min摇床中振荡培养96 h后，分别测定发酵液中纤维素酶活力。

1.3.5.2 微晶纤维素添加量对发酵的影响

根据预实验情况，初步确定微晶纤维素添加量为:0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%，油茶粕比例为8.0%，接种量为 12.0%，pH 值为 5.0，于 30℃、130 r/min摇床中振荡培养96 h后，分别测定发酵液中纤维素酶活力。

1.3.5.3 接种量对发酵的影响

根据预实验情况，初步确定里氏木酶的接种量为:2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%，油茶粕比例为8.0%，微晶纤维素添加量为1.0%，pH 为5.0，于30 ℃、130 r/min 摇床中振荡培养96 h后，分别测定发酵液中纤维素酶活力。

1.3.5.4 pH 对发酵的影响

根据预实验情况，初步选择 pH 为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，油茶粕比例为 8.0%，微晶纤维素添加量为 1.0%，接种量为 12.0%，于 30℃、130 r/min摇床中振荡培养4 d后，分别测定发酵液中纤维素酶活力。

1.3.6 粗酶液的制备

发酵完成后，取发酵液在8 000 r/min的条件下离心10 min，收集上清液，即为粗酶液。获得的粗酶液放置于0.05 mol/L的(NH4)2SO4溶液中，于4℃冰箱中保存不超过48 h。

1.3.7 纤维素酶活力的测定［19］

1.3.7.1 羧甲基纤维素酶活力(CMCA)的测定

以0.1 mol/L pH5.0的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液配制1%羧甲基纤维素钠(CMC－Na)底物溶液。取0.5 mL酶液加入1.5 mL CMC－Na溶液中，于40℃水浴保温30 min，测定还原糖的含量。空白对照组加等体积酶液于蒸馏水中，沸水浴10 min，灭酶活。

酶解反应中每小时由底物产生1.0 mg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位，用U/mL表示。

1.3.7.2 微晶纤维素酶活力(MCCA)的测定

在试管中加入0.25 g微晶纤维素和1.5 mL磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液，再加入0.5 mL适当稀释的酶液(空白对照加等体积灭活酶液)，40℃水浴反应30 min，测定还原糖的含量。

酶解反应中每小时由底物产生1.0 mg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位，用U/mL表示。

1.3.7.3 纤维二糖酶活力(CBA)的测定

以0.1 mol/L pH5.0磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液配制0.5%纤维二糖溶液。取1.5 mL纤维二糖底物溶液，加入0.5 mL适当稀释的酶液(空白对照加等体积灭活酶液)，40℃水浴反应30 min，测定还原糖的含量。

酶解反应中每小时由底物产生1.0 mg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位，用U/mL表示。

1.3.7.4 滤纸酶活力(PFA)的测定

于试管底部预先放置0.1 g新华滤纸，40℃水浴预热5 min，然后将相同温度下预热5 min的适当稀释酶液0.5 mL(空白对照加等体积灭活酶液)和1.5 mL磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液，40℃水浴保温30 min，测定反应后还原糖的含量。

酶解反应中每小时由底物产生1.0 mg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位，用U/mL表示。

1.3.7.5 还原糖测定

采用3，5 －二硝基水杨酸(DNS)法［20］。

3，5－二硝基水杨酸(DNS)试剂的配制:称取酒石酸钠182.0 g，500 mL蒸馏水中溶解，然后加入6.3 g 3，5 －二硝基水杨酸和21.0 g NaOH，再加入5.0 g重蒸酚和5.0 g亚硫酸钠，45℃水浴，期间不断搅拌至完全溶解，溶液清澈透明，冷却后，加蒸馏水定容至1 000 mL，贮于棕色瓶中，一周后即可使用，常温保存，可保存6个月。

葡萄糖标准曲线:取 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL 葡萄糖标准溶液各1.0 mL分别置于25 mL具塞试管中，各加入3，5－二硝基水杨酸溶液(DNS)2.0 mL，5 min沸水浴(DNS在碱性条件下与还原糖反应时生成有色化合物)，然后迅速冷却至室温，补加蒸馏水至25 mL，充分摇匀，在波长为549 nm处测定吸光度值(以空白溶液进行调零)，以葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

酶解液中还原糖含量的测定:在水浴中酶解反应后，迅速在沸水浴中加热5 min，冷却后加入4.0 mL DNS试剂，摇匀，沸水浴加热5 min，然后迅速冷却至室温，补加蒸馏水至25 mL，充分摇匀。波长549 nm处测其紫外吸光度值，根据葡萄糖标准曲线的回归方程，计算样品中还原糖的浓度，进而计算纤维素酶活力。

1.3.8 响应面设计

为了确定最优的发酵条件，运用Box－Behnken中心组合试验设计，在相应的最佳单个条件的基础上，设计成四因素三水平的试验和响应面分析实验。

1.3.9 验证试验

通过对响应面设计对得到发酵条件的结果加以验证，做3个平行，以此确定发酵工艺条件。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

以 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL 葡萄糖浓度为横坐标，549 nm 处测定的吸光度值为纵坐标绘制的标准曲线如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

由图1可知，在549 nm波长处，葡萄糖浓度与其吸光度值呈线性关系，得到的线性函数关系式为y=1.654 7x－0.009 8，其中 y表示 OD 值，x 表示葡萄糖浓度，R2为0.999 1，表明该曲线的线性关系良好，可用作葡萄糖的标准曲线使用。

2.2 单因素试验

2.2.1 油茶粕比例对纤维素酶活力的影响

以油茶粕作为发酵底物，设计了不同油茶粕添加量 2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0% 配制发酵培养基，分别测定发酵液中纤维素酶活力，探究油茶粕比例对纤维素酶活力的影响，结果如图2所示。

图2 油茶粕比例对纤维素酶活力的影响

由图2可知，油茶粕比例对4种酶活力有不同程度的影响。当油茶粕比例为2.0% ～8.0%，随着油茶粕添加量的增加，4种酶活力均呈升高趋势。其中当油茶粕比例为8.0%时，CMCA、MCCA和CBA分别达到最大值为 8.12、7.45 和 4.71 U/mL。当油茶粕比例为 8.0% ～10.0%时，CMCA、MCCA 和 CBA呈下降趋势，而FPA继续上升，当油茶粕质量分数为10.0%时，FPA达到最大值为4.33 U/mL。当油茶粕比例为10.0% ～12.0%时，CMCA、MCCA 和 CBA 变化趋于平缓，而FPA呈下降趋势。综合考虑，8.0%可视为较佳的油茶粕比例。

2.2.2 微晶纤维素添加量对纤维素酶活力的影响

以微晶纤维素作为里氏木霉发酵的诱导剂，根据预实验结果，设计了微晶纤维素添加量分别为0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%配制发酵培养基，测定发酵液中纤维素酶的酶活力，探究微晶纤维素添加量对纤维素酶活力的影响，结果如图3所示。

图3 微晶纤维素添加量对纤维素酶活力的影响

由图3可知，当微晶纤维素添加量为0.2% ～2.2%时，随着微晶纤维素添加量的增加，4种酶活力呈先上升后下降的变化。当微晶纤维素添加量为1.0%时，CMCA 最大值为7.31 U/mL，MCCA 最大值为8.98 U/mL，FPA 最大值为 5.55 U/mL，CBA 最大值为4.48 U/mL。当微晶纤维素添加量为0.2% ～1.0%时，4种酶活力上升显著，当微晶纤维素添加量大于1.0%时，4种酶活力下降不显著。综合考虑，1.0%可视为最佳的微晶纤维素添加量。

2.2.3 接种量对纤维素酶活力的影响

一般来说，接种量与酶浓度有密切关系。不同的接种量(2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%)的菌种分别接种于发酵培养基中(其余条件均相同)，以发酵液中纤维素酶活力为评价指标，探究接种量对纤维素酶活力的影响，试验结果如图4所示。

由图4可知，当接种量为2.0% ～14.0%时，随着接种量的增加，4种酶活力均先升高后下降。当接种量为8.0%时，MCCA达到最大值为8.44 U/mL，此时，CMCA 为7.62 U/mL，FPA 为 4.41 U/mL，CBA为4.31 U/mL。当接种量为 8.0% ～12.0% 时，MCCA呈下降趋势，而CMCA继续上升，当接种量为12.0%时，CMCA 达到最大为 8.26 U/mL，此时 MCCA 为7.83 U/mL，FPA 为 4.37 U/mL，CBA 为 5.50 U/mL。当接种量为10.0%时，FPA达到最大值为5.24 U/mL，此时 CMCA 为 7.93 U/mL，MCCA 为8.13 U/mL，CBA 为 4.71 U/mL。综合考虑，12.0%可作为较合适的接种量。

图4 接种量对纤维素酶活力的影响

2.2.4 pH对纤维素酶活力的影响

发酵培养基中的pH起到调节离子酸碱度的作用，它影响着菌体生长速率和产酶能力，微生物只能在一定pH范围内条件下的生长。试验以不同的pH值:2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，探究其对纤维素酶活力的影响，结果如图5。

图5 pH对纤维素酶活力的影响

由图5可知，当 pH 值为2.0～5.0时，随着 pH的增大，CMCA、MCCA和FPA均呈上升趋势，但CMCA和MCCA上升较为显著。当pH值为5.0时，3种酶活力均达到最大值，分别为 7.93、8.91、4.05 U/mL。当pH 值为5.0～8.0时，随着 pH 的增大，CMCA、MCCA和FPA均呈下降趋势。当pH值为2.0～6.0时，随着pH值的增大，CBA的几乎没有变化，当pH值大于6.0时，CBA呈下降趋势。

综合考虑，pH 5.0可作为较佳的pH条件。

2.3 响应面优化里氏木霉发酵工艺

根据单因素试验结果可知，油茶粕比例为8.0%、微晶纤维素添加量为 1.0%、接种量为12.0%、pH为5.0为较佳的发酵条件。运用Box－Behnken中心组合试验设计，在相应的单个条件的基础上，选取附近的两个条件，确定3个水平，从而设计成四因素三水平的试验，见表1。

根据上述单因素试验发现，CMCA受油茶粕比例、微晶纤维素添加量、接种量和pH这四个因素的影响，与另外3种酶活力相比，更为显著，因此以CMCA为响应值，试验设计与响应值结果见表2。

表1 Box－Behnken试验设计因素水平

表2 Box－Behnken试验设计与响应值表

以里氏木霉的CMCA为响应值，利用Design Expert8.0软件进行回归分析和方差分析，结果见表3，拟合得到回归方程:

CMCA=8.50+0.27A － 0.047B+0.052C －0.074D －0.11AB －0.010AC －0.028AD －0.022BC －0.067BD+0.092CD －0.47A2－0.22B2－0.093C2－0.30D2

由表3可知，模型P＜0.000 1，表示该模型达极显著水平;失拟项 P=0.098 6＞0.05，结果差异不显著，说明无其他因素显著影响本项研究，即模型合适。试验中一次项A、二次项A2和二次项D2均呈极显著。各因素影响程度从大到小依次为:A＞D＞C＞B，即油茶粕比例＞pH＞接种量＞微晶纤维素添加量。本模型决定系数R2=0.950 8，说明响应值CMCA测定值和预测值间拟合度良好，校正系数=0.901 6，说明模型能解释90.16%的响应值变化。

表3 CMCA方差分析

2.4 综合优化分析

根据回归分析结果，运用Design－expert 8.0寻找产酶的最高点以及相对应的因素水平，所拟合的响应曲面能够比较直观地反映各个因素之间的交互作用，以及对响应值即CMCA的影响，极值条件在曲面的圆心处［21］。等高线可以直观地反映出，两个因素交互作用的显著程度，椭圆表示两因素交互作用显著，而圆形则表示两个因素交互作用不显著［22］。

根据Design－Expert 8.0软件优化分析，发现油茶粕比例(A)与微晶纤维素添加量(B)、油茶粕比例(A)与接种量(C)、微晶纤维素添加量(B)与pH(D)和接种量(C)与pH(D)的等高线呈椭圆形，说明这些因素的交互作用较为显著。通过对回归方程求极值，可得出当 A=8.6%，B=0.93%，C=12.48%，D=4.9时，即油茶粕比例为8.6%，微晶纤维素添加量为 0.93%，接种量为 12.48%，pH 值为 4.9，此时模型预测的酶活力达到的最大为8.55 U/mL。

2.5 响应面结果验证

按照模型得到的发酵条件进行验证试验，做三次平行实验，得到的CMCA平均值为8.47 U/mL，与理论预测值相比，相对误差小于1%，说明该模型可以较好地反映出羧甲基纤维素酶活力的影响。此外，最优条件下，微晶纤维素酶活力为9.28 U/mL，纤维二糖酶活力为5.05 U/mL，滤纸酶活力为5.44 U/mL。

3 讨论

里氏木霉酶系水解油茶粕受多种因素的影响，如底物浓度、接种量、温度、pH 值、发酵时间［23－24］等，通过控制这些因素，优化发酵条件，选择最佳的产纤维素酶条件。底物是菌株的主要营养物质的来源，其含量直接影响着菌株的生长繁殖。接种量也对菌株发酵产酶有一定的影响。当接种量较低时，菌株产酶量较少，不利于发酵的进行;当接种量过高时，菌体密度过大，培养基营养成分消耗较快，造成后续发酵难以进行，不利于发酵持续推进。每种菌株都有其最适的生长环境，因而发酵温度、pH值也会影响发酵产酶效果。另外，纤维素酶是诱导酶，研究发现槐糖、微晶纤维素、乳糖、纤维二糖对里氏木霉产纤维素酶均有诱导作用，其中以槐糖和微晶纤维素的诱导效果最好，但槐糖的价格较高，不适合实际应用［25－26］。

试验发现分油茶粕比例、微晶纤维素添加量、接种量和pH，对羧甲基纤维素酶活力、微晶纤维素酶活力、纤维二糖酶活力和滤纸酶活力都有不同程度的影响，油茶粕比例对4种酶活力影响较显著。在单因素试验中，当油茶粕比例为8.0%时，4种酶活力均达到最大。微晶纤维素添加量对4种酶活力的影响较为相似。接种量和pH值对羧甲基纤维素酶活力和微晶纤维素酶活力影响较为显著，而对纤维二糖酶活力和滤纸酶活力的影响并不显著。这可能是因为里氏木霉的纤维素酶是一种诱导型的复合酶系，羧甲基纤维素酶和微晶纤维素酶在纤维素酶系列中含量较大，易于表达，而纤维二糖酶所含的比例较小［27－29］。因此为了增强里氏木霉的纤维素酶活力，诱变选育出高产纤维素酶的突变菌株至关重要。

4 结论

以油茶粕为底物，对里氏木霉发酵进行培养，研究了油茶粕比例、微晶纤维素添加量、接种量和pH对里氏木霉纤维素酶活力的影响。在单因素实验的基础上，采用响应面分析，优化得到发酵条件为:油茶粕比例为8.6%，微晶纤维素添加量为0.93%，接种量为12.48%，pH值为4.9。在该条件下，羧甲基纤维素酶活力为8.47 U/mL，微晶纤维素酶活力为9.28 U/mL，纤维二糖酶活力为 5.05 U/mL，滤纸酶活力为5.44 U/mL。