基于PTN系统分析转基因稻米油脂的非预期变异效应

赵 艳 史玉倩

(浙江工商大学食品与生物工程学院，杭州 310018)

水稻是全球主粮作物之一，转基因(genetically modified，GM)水稻在中国、亚洲和世界上其他地区都具有潜在重大利益和深远影响［1］。随着转Bt抗虫水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”生产应用安全证书的颁发和延期获准，有关GM水稻安全性的争论日趋激烈。从分子生物学角度，GM作物除了外源基因编码产物赋予的可预期特定遗传效应外，还可能存在其他不可预期的变异效应，简称为非预期效应(unintended effects)。GM作物的非预期效应可能改变相关食品的营养品质，甚至产生对人类和动物有害的毒素。系统比较研究能为GM作物的非预期效应安全性评估提供重要线索［2］。1993年OECD提出GM食品风险评估的实质等同性原则。2004年OECD建议采用食品关键营养因子和抗营养因子对水稻新品种进行评估，营养因子包括氨基酸、脂肪酸、矿物质和维生素等，抗营养因子包括植酸、植物血凝素和胰蛋白酶抑制剂等［3］。油脂是稻米的重要成分，虽然含量不高，如糙米约为3%，精米约为0.8%，糠约为20%，但多为优质不饱和脂肪酸或淀粉油脂复合物［4］，不仅营养价值高，而且与稻米的食用品质及陈化劣变密切相关。分析GM稻米油脂的非预期效应是安全性评估的重要环节。Jiao等［5］研究表明与亲本相比，转基因水稻种子的主要脂肪酸组分发生了非预期变异，其中相对含量的变异幅度为19% ～38%，其中T2的C16∶0降低21%。Choi等［6］发现与对照相比，转 bar基因稻米主要脂肪酸组分未发生显著改变，只有稻米油脂中占比极低的C14∶0和C16∶1在含量上发生了显著变异。Nam等［7］报道耐旱转基因稻米和非转基因对照相比，硬脂酸(C18∶0)和鳕油酸(C20∶1)的含量增加。但Wang等［2］发现转Cry1ab/ac基因水稻种子与非转基因对照油脂含量和脂肪酸组分及含量均没有显著差异。前人研究仅采用非转基因亲本作为单一对照样本，即使GM作物品系产生了与亲本不等同的非预期变异，也无法确认这种非预期效应是由转基因技术引发的。基于此，我们课题组首次提出了GM农作物安全性评价的PTN(parent control－transgenic plant－nontransgenic control)系统观念并用于GM水稻种子蛋白质组分的非预期变异分析，即对转基因品系T(transgenic line)依据“实质等同性”原则进行评价时，对照样本中除了常规亲本P(parent line)外，增加遗传学背景相关的非转基因组培再生株系NR(non－transgenic regenerated line)和非转基因遗传分离阴性后代株系NS(non－transgenic segregated negative offspring line)等遗传学对照样本，经过样本间的多重比对分析，能解析GM品系非预期效应的技术来源并客观评价其安全性［8］。本研究以抗草甘膦GM水稻为材料，根据PTN系统分析GM稻米油脂含量和脂肪酸组成的非预期效应，为GM水稻的安全性评价提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

亲本材料:粳稻品种日本晴(P1)和PJ574(P2)由中国水稻研究所种质创新课题组提供。转2mG2－epsps基因抗草甘膦纯合株系T13和T22:分别以P1和P2的成熟胚愈伤组织为受体，利用基因枪介导洁净DNA转化法将目的基因2mG2－epsps表达框(包括CaMV35S启动子、2mG2－epsps编码区、nos终止子)［9］导入水稻获得;T13相应的非转基因组培株系对照NR13和非转基因阴性分离株系NS13，T22相应的对照株系NR22和NS22来源描述参见前期论文［8］。所有水稻材料于12月种植于海南转基因实验田，次年收获，水稻种子自然晒干后保存于4℃冰箱备用。

1.2 稻米油脂的提取和定量测定

水稻种子脱壳后磨粉过80目筛，稻米油脂提取按参考文献［10］。准确称取米粉m1(g)到离心管，按料液比1∶3加入正己烷，摇匀振荡，40℃水浴锅中浸提15 min，中间颠倒混匀3次。8 000 r/min离心10 min收集上清，重复提取两次合并上清，在真空浓缩仪中40℃去除溶剂，干燥2 h至恒重，得油脂称质量m2(g)，置4℃冰箱备用。

油脂含量=m2/m1×100%

油脂含量变异幅度=(水稻样本T/NR/NS油脂含量－亲本P油脂含量)/亲本P油脂含量×100%

1.3 稻米脂肪酸组分及含量分析

参照文献［11－12］进行脂肪酸甲酯化。将稻米油脂提取物溶于0.2 mL氯仿:甲醇(2∶1)，加0.3 mL盐酸甲醇溶液(5%，V/V)，85℃静置1 h。冷却至室温后加1mL正己烷提取2 h，吸取上清进行气相色谱－质谱(GC－MS)分析。采用Agilent 7890A－5975C气相色谱－质谱仪，FID检测器，HP－INNOWAX毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.5μm)。载气为高纯度He，恒压模式，压力为2.047 6 psi;进样口温度为250℃，进样量1μL，分流比为20∶1。升温程序:50℃保留1 min，以25℃/min升至200℃，再以3℃/min升温至230℃，保持23 min。EM电压为2 094eV，质量数扫描范围:33～500 amu，离子源温度为230℃。四级杆温度为150℃。质谱峰识别是利用NIST laboratory标准谱库检索和基于标样(FAME Mix，C4－C24)出峰保留时间，并根据人工谱图解析，确定脂肪酸组成，以面积归一化法计算各组分的相对含量。

脂肪酸相对含量变异幅度=(水稻样本T/NR/NS脂肪酸相对含量－亲本P脂肪酸相对含量)/亲本P脂肪酸相对含量×100%

1.4 数据处理与统计分析

每个样品设3次重复，结果以X±s(平均数±标准误差)表示。分别以P1和P2为对照，应用Origin软件对其他样本(T、NR、NS)数据进行单因素方差分析和多重比较分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

采用双倍单边检验(two one－sided tests，TOST)程序［13－14］对样本间差异进行实质等同性判断。2个样本之间置信区间取90%，即100(1－2×α)%，显著水平α=0.05，被认为2个样本存在显著差异。等同性边界根据北欧部长理事会推荐标准定义为平均数±20%，变异幅度超过20%即判断为不等同。

2 结果

2.1 GM水稻及其多重对照样本的稻米油脂含量变异分析

T13和T22两个GM株系及其相应对照样本的糙米油脂含量比较结果见表1。所试糙米油脂含量范围为2.06% ～3.35%，亲本品种P2比P1降低了38.51%，差异极显著，根据TOST判定二者不等同，说明天然品种差异影响水稻糙米油脂含量。T13和T22的糙米油脂含量与相应亲本差异极显著，均不等同，T13比P1降低了21.79%，T22比亲本P2增加了20.87%。

表1 转基因水稻与其多重对照样本糙米油脂含量变异分析

在相同遗传世代和种植环境下，GM水稻非预期效应的技术来源主要包括组织培养无性系变异和外源基因插入突变。NS对照株系在转基因过程中经历的了如下过程:2mG2－epsps基因导入细胞"2mG2－epsps在姐妹同源染色体整合"草甘膦抗性筛选和植株再生"转基因姐妹染色体的孟德尔遗传分离"NS株系获得。该过程中受体细胞经历了外源基因的导入和分离逸出事件，简称为转基因穿梭，与转基因过程密切相关。因此，NS非预期效应的技术来源包括组织培养无性系变异效应和转基因穿梭效应;NR对照株系的非预期变异主要由组织培养无性系变异效应引起，组织培养技术被认为是安全的常规育种技术，其无性系变异效应无需评估。根据PTN系统样本间的多重比较信息(表2)解析GM水稻非预期效应的技术来源，发现T22的油脂含量改变趋势与NR22一致，而且 NR22的油脂含量变异幅度(40.29%)比T22(20.87%)要大，说明 T22油脂含量变异主要来源于转基因过程中的组织培养无性系变异效应，受外源基因插入突变的影响较小。T13的组培对照株系NR13和亲本P2相比油脂含量差异不显著，说明T13的油脂含量变异可能主要来源于转基因插入突变效应。

2.2 GM稻米脂肪酸组成的变异分析

由于样品量多，仅将GM水稻T13株系和其亲本P1的糙米脂肪酸检测气相色谱－质谱图示于图1。由图1可知2个样本的脂肪酸组分相同，都包括12个脂肪酸峰，不同样本出峰时间在误差范围内。GM株系T13和非转基因多重对照样本P1、NR13、NS13相比，糙米脂肪酸组分没有改变，只是脂肪酸组分的图谱峰值不完全一致，说明有些组分相对含量存在差异，T22及其对照样本的分析结果与此类似。

2.3 GM水稻糙米脂肪酸组分相对含量的变异及技术来源分析

分别以P1和P2为对照，对各样本脂肪酸组分的相对含量进行统计分析，结果汇总于表2和表4，并将各PTN系统实验样本的脂肪酸含量变异趋势和变异幅度及实质等同性判定结果分别汇总于表3和表5。表2和表4结果表明，GM水稻株系与其相应的多重对照样本的脂肪酸组成相同，主要脂肪酸组分为棕榈酸、油酸和亚油酸，且不饱和脂肪酸含量占70%以上，只是部分脂肪酸相对含量发生了显著变异。T13有4种脂肪酸的相对含量与P1差异显著，而NR13和更为严谨的遗传学对照样本NS13分别有5种和7种脂肪酸相对含量与P1差异显著(表2)，说明糙米脂肪酸组分相对含量的变异效应可能受组织培养的影响较大。其次，T13中营养价值较高的不饱和脂肪酸含量比P1显著增加，而NR13的不饱和脂肪酸含量显著降低，可见非预期变异效应也可能改善稻米营养品质。

图1 转基因水稻株系T13与其亲本P1糙米脂肪酸气相色谱－质谱图

表2 转基因水稻T13与其多重对照样本糙米脂肪酸组分相对含量变异分析/%

表3 转基因水稻T13与其多重对照样本糙米脂肪酸组分相对含量(%)的变异幅度及实质等同性分析

表3结果可知，在12种脂肪酸中，按照TOST标准，T13只有亚麻酸的相对含量比 P1增加了23.75%，与P1不等同，而组培对照株系NR13的亚麻酸相对含量的变异幅度(53.20%)更大;T13油酸相对含量比亲本P1显著降低，且变异趋势与NR13一致，只是NR13的降低幅度(7.08%)显著大于T13(3.68%)，表明GM株系T13的亚麻酸和油酸相对含量的变异可能主要来源于组织培养无性系变异效应。同理，可以推测T13的亚油酸和硬脂酸相对含量变异受外源基因插入突变效应的影响较大。

由表4可知，T22糙米有10种脂肪酸相对含量与P2差异显著，NR22和NS22分别也有10种和9种脂肪酸相对含量与P2差异显著且变异脂肪酸种类基本相同，说明T22糙米脂肪酸相对含量变异主要来源于组织培养无性系变异效应。就不饱和脂肪酸相对含量而言，T22比P2显著增加，NR22与P2相似，而NS22也比P2显著增加，说明转基因过程的穿梭效应对提高T22不饱和脂肪酸含量的贡献较大，组织培养无性系变异效应的影响较小。

表5显示T22糙米脂肪酸组分相对含量的变异情况及其与P2的实质等同性分析结果。在8种不等同组分中，T22花生酸相对含量变异幅度最大。根据多重对照样本分析其变异效应来源可知，T22的花生酸相对含量比P2增加了约3倍，变异幅度与NS22相似，却显著高于NR22(增幅1.84倍)，可见T22花生酸含量变异主要受转基因过程的穿梭效应和组织培养无性系变异效应的双重影响，受转基因插入突变效应影响很小。同理，T22的棕榈油酸、油酸、鳕油酸的含量变异效应来源与花生酸相似。T22的硬脂酸、亚麻酸和二十二碳烷酸的相对含量与NR22、NS22对照品系之间差异不显著，变异方向也完全一致，说明其主要来源于组织培养无性系变异效应，几乎不受转基因插入效应和转基因穿梭效应影响。T22的芥酸相对含量与P2实质不等同，然而对照株系NR22和NS22的芥酸含量与P2无显著差异，由此可推断该变异主要由转基因插入突变效应引发。

表4 转基因水稻T22与其多重对照样本糙米脂肪酸组分相对含量变异分析/%

表5 转基因水稻T22与其多重对照样本糙米脂肪酸含量(%)变异幅度及实质等同性分析

表6 两亲本品种稻米脂肪酸组分含量(%)的差异比较和实质等同性分析

2.4 GM水稻糙米脂肪酸组分相对含量变异的安全性评价

两粳稻亲本品种P1和P2的脂肪酸相对含量差异反映水稻天然品系之间的差异，以P1为对照，将P2脂肪酸组分相对含量的变异趋势和幅度汇总于表6，并根据TOST判断其与P1的实质等同性。在12种脂肪酸组分中，有6种脂肪酸组分在P1和P2之间不等同，其中花生酸的含量差异幅度最大，P2比P1降低65.23%。

参照P1和P2之间的差异情况和非预期效应的技术来源追溯结果，可分析GM稻米脂肪酸组分非预期变异的安全性。综合而言，T13只有亚麻酸的相对含量比P1增加23.75%，低于P1和P2两亲本之间的差异幅度62.87%，说明转基因技术对GM稻米脂肪酸含量的变异效应小于水稻品种天然基因型差异。T22株系8种不等同组分中，亚麻酸相对含量的变异幅度(27.50%)低于P1和P2两亲本之间的差异幅度62.87%，棕榈油酸、硬脂酸、油酸、二十二碳烷酸的相对含量变异幅度(23.07% ～56.00%)虽然高于P1和P2之间的差异幅度(12.25%～29.36%)，但仍低于P1和P2两亲本脂肪酸组分相对含量的最大差异幅度65.23%，说明这5种脂肪酸相对含量的变异幅度在安全范围之内。然而T22的其余3种不等同脂肪酸组分的变异安全性值得进一步评估，原因在于:花生酸和鳕油酸相对含量的变异幅度(分别为303.34%和124.41%)远超出P1和P2之间的最大差异幅度65.23%，且基于PTN系统分析知其变异效应包括转基因过程的穿梭效应;芥酸的相对含量变异幅度虽然低于65.23%，但变异效应主要来自转基因插入突变效应。

3 讨论与结论

“实质等同性”原则被广泛应用于转基因食品的安全性评估。本文基于PTN样本系统通过分析GM水稻T13、T22与其对照样本之间的稻米油脂含量及脂肪酸组分差异，追溯非预期效应的技术来源，发现转基因技术影响稻米总油脂含量。如T13油脂含量比P1降低了21.79%，T22的油脂含量比P2增加了20.87%，但两个 GM株系的油脂含量(2.62%和2.49%)仍介于P1(3.35%)和P2(2.06%)之间(表1)。这与前人报道的结果类似，即转基因稻米的油脂含量变异幅度低于天然水稻品种之间的差异［2，13］，说明转基因技术对稻米总油脂含量的非预期变异效应小于天然的水稻品种基因型影响，属于安全范围内的非预期变异。分析GM稻米总油脂含量非预期效应的技术来源(表1)发现，T13和T22的油脂含量变异主要来源分别为转基因插入突变效应和组织培养无性系变异效应，可见不同GM株系非预期变异效应的技术来源存在差异，原因在于它们分别属于不同转基因事件，这符合基因枪转化法介导外源基因在受体基因组中随机整合的技术特点。

本研究所有糙米样本均检测出12种脂肪酸，主要脂肪酸为棕榈酸、油酸和亚油酸，且不饱和脂肪酸相对含量在74.16% ～75.60%之间(表2和表4)，与常规水稻品种的脂肪酸组成分析结果一致［15］。GM株系T13和T22与各自亲本相比，糙米脂肪酸组分种类并未发生增减，只是某些脂肪酸的相对含量发生了非预期变异，这与前人对GM稻米脂肪酸非预期变异效应的研究结果类似［2，5－6，12，16］。根据 TOST程序判断，T13只有亚麻酸的相对含量与P1实质不等同，而T22品系有8种脂肪酸组分的相对含量与P2不等同(表3和表5)，说明稻米脂肪酸组分变异在不同GM品系间差异较大，GM作物的安全性评估应遵循个案分析原则。

基于实质等同性原则和TOST评判标准，结合PTN系统参照样本的变异效应技术来源追溯结果，可知GM水稻T22稻米中的花生酸、鳕油酸和芥酸相对含量属于实质不等同的非预期变异，变异效应来源包括转基因穿梭效应和转基因插入突变效应，需要进一步安全性评估。从食品安全角度，虽然T22稻米花生酸和鳕油酸相对含量与P2相比增加幅度分别高达303.34%和124.41%，但实际相对含量只有1.21%和0.86%，而且这两种脂肪酸都是食品中常见的不限量营养脂肪酸，因此这种变异是安全的。至于芥酸，由于摄入芥酸含量为10% 以上的菜籽油能够抑制大鼠的生长性能和肝组织长链脂肪酸的氧化速率，增加芥酸在不同组织中的累积，并导致心肌脂肪代谢障碍，因此美国FDA规定芥酸含量不超过2%才被允许添加到成人和儿童食品中，而不允许添加到婴儿食品中。GB 1536—2004《菜籽油》规定脂肪酸组成中芥酸含量小于3%为低芥酸菜籽油［17］。根据糙米油脂含量和芥酸相对含量估算，本文8个供试样本的糙米芥酸含量位于0.04%～0.09%之间，远低于限量标准，不存在安全风险。T22稻米芥酸相对含量比P2降低了23.69%，该变异对其食用安全性更有利。综合而言，供试的2个GM株系稻米油脂含量和组分确实存在非预期变异效应，会影响其营养品质，但并不存在食品安全隐患。只是GM水稻不同株系间差异较大，安全性评估要严格遵循个例分析原则。