荷移光度法测定谷物中嘌呤含量的实验

刘晓庚 刘季敏 何诗雨 曹崇江 刘 琴周 彤 杨晓童 谢忠良 刘崇靖 汪若瑾

(南京财经大学食品科学与工程学院;江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心;江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023)

研究表明痛风及高尿酸血症与饮食关系非常密切，且近年来这类患者逐年增加［1］;另外，通过限制富含嘌呤食物的摄入来预防痛风有良好效果［2－3］。在全球饮食结构不断变革的今天，人们对膳食营养的需求也随之改变，一些传统的不良饮食习惯都在影响着人们的健康。目前有关食品中嘌呤含量的测定方法主要有紫外－可见光谱法［4］、红外光 谱 法［5］、荧 光 光 谱 法［6－8］、高 效 液 相 色 谱法［9－12］、质谱法［13－14］、毛细管电泳法［15－19］和电化学法［20－21］等，而国内鲜见统一的食品中嘌呤含量测定方法［22］，因而无法在膳食方面提供有效的科学指导［23］。针对现阶段最公认的嘌呤测定方法——HPLC法存在着操作过程比较繁琐，使用试剂多，且有些还有毒或有害，对环境有污染等不足之处［24］;其他方法有的操作繁杂成本高、有的稳定性差达不到测定要求、有的适用范围狭窄等。为此，在已探讨的荷移光度法［25－29］的基础上，用荷移光度法测定谷物中嘌呤化合物含量，旨在寻得一种绿色无污染、操作简便、测定速度快又准确的谷物嘌呤测定新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

玉米、小麦、稻米(籼米、粳米、糙米)、稻壳、米糠、大豆均由江苏省粮食局粮油质量监测所提供，小米、马铃薯、绿豆购自苏果超市当年产无病害商品。

鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、四氯对苯醌、氯醌酸、二甲亚砜(DMSO)，所用试剂均为分析纯。

1.1.2 设备与仪器

Allegra 64R离心机(Beckman Coulter);RE52CS旋转蒸发仪;KH－300DE型超声波清洗器;UV－8000A型双光束紫外/可见分光光度计;agilent1260高效液相色谱。

1.2 方法

1.2.1 标准储备液配制

腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤分别用少量0.1 mol/L NaOH+水溶解后再用无水乙醇配成为1.00× 10－2mol·L－1的标准储备液，再逐级稀释成1.00 ×10－4mol·L－1标准使用溶液，备用。

1.2.2 样品处理

按文献［12］方法并作修改后对试样处理，具体为:称取2 g无病害干净鲜样品或0.4 g干样品(均精确至0.1 mg)于研钵中，研碎后定量转移至烧瓶中，加入10 mL 70%高氯酸，在沸水浴中进行回流水解45 min，冷却后，用7 mol/L KOH中和至pH 7抽滤，滤液用1 mol/L磷酸调pH至3，再于3 500～4 000 r/min下离心15 min。清液于沸水浴上减压旋蒸至干，再用无水乙醇超声洗涤提取物4～5次，收集洗涤液以无水乙醇定容至50.0 mL，依次经G5砂芯漏斗和0.22μm膜过滤，将待测试液于0～4℃保存备用。

1.2.3 测定操作

取1.00 mL样液于10 mL容量瓶中，加入1.00 mL 1 ×10－3mol·L－1氯醌酸乙醇液，摇匀，用无水乙醇定容，在一定温度下反应一段时间后，再用1.0 cm的石英比色皿以试剂空白为参比，测得532 nm处吸光度值(ΔA)。

1.2.4 测定条件优化

用单因素考察法优化荷移剂种类、测定介质、酸度、荷移反应温度、荷移反应时间和反应物配比。然后，与现行的HPLC法［11］进行对比。HPLC条件为色谱柱:Agilent XDB－C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm);流动相:水－甲醇－冰乙酸－10%四丁基氢氧化铵(879/100/15/6);柱温:30℃;流速:1.0 mL/min;进样量:10.0μL;检测波长:254 nm。

1.2.5 数据处理

实验数据采用Excel 2010绘图。Box－Behnken响应面设计实验的多元回归分析及方差分析均用Design－ Expert 8.0.6软件处理。其他数据用SPSS17.0进行统计分析与处理，结果以“平均值±SD”表示。

2 结果与讨论

2.1 荷移剂的选择

在相同浓度下分别以氯醌酸、四氯对苯醌、茜素、茜素红、苦味酸、对苯醌、2，4－二硝基苯酚和TCNQ(2，5－环己二烯－1a，4a－双丙二腈或四氰代苯醌二甲叉)为荷移剂与鸟嘌呤按1.2.3操作方法进行反应，测得其反应后的UV－VIS(紫外可见光)吸收曲线(见图1)。由图1可知氯醌酸的荷移反应产物的UV－VIS吸收曲线最为理想，吸收曲线的稳定性和重现性均佳且λmax均为532 nm，为此选择氯醌酸为荷移剂。为了求得嘌呤与氯醌酸荷移反应的关系，进一步实验了四种嘌呤及其混合物分别与氯醌酸反应后UV－VIS吸收曲线(见图2)。从图2可见，这几种嘌呤及其混合物均能与氯醌酸发生荷移反应形成良好的UV－VIS吸收曲线，尽管单独嘌呤的荷移吸收峰位置和吸收强度稍有差异，但是它们的混合物表现出了极好的吸收曲线，而且混合物吸收峰与鸟嘌呤的峰存在极佳的相关性，这为用氯醌酸荷移光度法测定嘌呤奠定了客观基础。故选择氯醌酸为荷移剂，且通过以鸟嘌呤为代表来考察并确定有关荷移光度法的测定条件。

图1 不同荷移剂与鸟嘌呤反应的吸收光谱

图2 四种嘌呤及其混合物与氯醌酸反应的吸收曲线

2.2 测定介质的确定

荷移反应的介质一般选用非水介质，故分别对常用无水乙醇、甲醇、乙腈作为介质按照实验1.2.3操作方法，在其他条件不变，测定其吸收曲线(见图3)。由图3可知，以无水乙醇作为介质最佳，所以后续实验选用无水乙醇作为测定介质。

图3 不同介质的影响

2.3 水分的影响

在其他条件不变下，调节体系的水分含量分别为 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%按照实验1.2.3操作方法，测得其吸收曲线(见图4)。由图4可知，体系水分在3.0%以内的ΔA532值基本恒定，所以测定中控制水分2.5%～3.0%。

图4 反应体系水分量的影响

2.4 酸度及酸度调节剂的影响

按1.2.3操作方法，在其他条件不变，分别用磷酸、盐酸和硝酸将体系pH均调至5～6，测得其吸收曲线(见图5)。由图5及实验现象表明，加硝酸或盐酸后，体系颜色由紫红色变为了浅黄色，UV－VIS曲线在可见光区也无吸收峰，这可能是硝酸的氧化性及氮和氯的供电子作用所致，因此，不宜用硝酸或盐酸调节酸度。故选择磷酸为酸度调节剂。

在其他条件不变，按1.2.3操作方法分别用磷酸将pH调至5.0、6.0和用氢氧化钠将pH调至8.0、9.0后分别测定其吸收曲线(见图6)。由图6可知，当pH＞7呈碱性时吸收峰消失，荷移反应受－OH的供电子作用而被完全破坏;而pH 5～6时吸收曲线差别较小且峰值大，pH 7(中性)时吸收曲线形状有所改变但吸收峰值与pH 5～6时相一致。可见实验中也可不额外加酸度调节剂，即在中性条件下直接测定即可。

图5 不同酸度调节剂的影响

图6 不同酸度(pH值)的影响

2.5 反应温度的影响

在其他条件不变，按1.2.3操作方法，分别在10℃、20℃、30℃、40℃水浴中保温反应20 min后，再在室温下测得吸收曲线(见图7)。从图7可见，温度对其荷移反应影响甚小，吸收曲线形状几乎不变，这也表明在此温度范围内该荷移反应机理相同;但升温对ΔA532值略有增加且低温增幅比高温大得多，这可认为该反应为吸热反应，且吸热会随温度升高而略微增加。为方便操作故后续实验选择室温(约25℃)下进行。

图7 不同温度的影响

图8 不同反应时间的影响

2.6 反应时间的影响

在其他条件不变，按1.2.3操作方法，分别测定反应5、10、20、30、40、50 min 和1、2、3、6、20 h 时的吸收曲线(见图8)。由图8可知，反应时间从5～30 min内其ΔA532值和吸收曲线都几乎不变，在3 h以前吸收曲线形状无明显变化;6 h和20 h的吸收曲线形状呈现出无规律的变化，溶液颜色逐渐消失，20 h时颜色完全消失。在450 nm后也无吸收峰，但在360～450 nm呈现杂乱的吸收，这反映出该荷移络合物的不稳定性和20 h时这种络合物已完全解离。这样的变化不会影响该方法用于分析测定的可行性，因为它给测定留出了足够的稳定时间。因此，以选择反应时间为5～30 min为宜，本实验选用反应时间为8 min。

2.7 反应的化学计量确定

由于荷移反应是一步完成的反应，适合用平衡移动法［25］确定所形成络合物的组成。因此在其他条件不变，按1.2.3操作方法只改变氯醌酸的用量进行测定，其结果如图9所示。由图9可知，吸光度随氯醌酸用量的增加而升高，只是在达到稳定计量点前较计量点后稍许显著升高。当氯醌酸用量与鸟嘌呤用量摩尔比达到1∶3时，特征吸收峰最为完美，且吸光度最大。故认为氯醌酸与鸟嘌呤能形成摩尔比1∶3的稳定络合物。

图9 氯醌酸与鸟嘌呤反应配比的影响

2.8 荷移反应的机理推测及反应的络合常数与标准自由能

2.8.1 荷移反应的机理推测及反应模型

根据荷移反应的构效关系［8］可知，氯醌酸为平面型π电子接受体，而嘌呤分子中均有孤电子对可作为电子给予体，在乙醇溶液中鸟嘌呤分子与氯醌酸可形成n－π*或π－π*型类似夹心面包式荷移络合物。基于测得其荷移络合物组成配比为n氯醌酸∶n鸟嘌呤=1∶3，其荷移反应可表示为:

2.8.2 络合常数与标准自由能

2.9 实际样品的测定及其效果

2.9.1 标准曲线

分别取鸟嘌呤和混合总嘌呤的标准使用溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，按 1.2.3 测定操作方法进行标准曲线的测定，结果显示鸟嘌呤和混合总嘌呤的浓度在0～1×10－4mol·L－1范围内有良好线性 关 系，且 其 线 性 方 程 分 别 为 ΔA鸟嘌呤=0.034c鸟嘌呤+0.005(R2=0.995 2)、ΔA总嘌呤=0.028 5c总嘌呤+0.007 1(R2=0.992)，其摩尔吸光系数分别为 ε鸟嘌呤=3.1 ×104L·mol－1·cm－1(这一结果与用Benesi－Hildebrand方程求算的结果相同，从另一个侧面佐证了测定方法的可靠性)、ε总嘌呤=3.6×104L·mol－1·cm－1;其检出限按信噪比 S/N=3［11］算得相对应的嘌呤浓度分别为 2×10－6mol·L－1、9×10－6mol·L－1。

2.9.2 实际样品的测定与效果分析

按1.2.2的方法，先将试样进行嘌呤提取，再将制得的嘌呤按1.2.3方法分别对实际样品测得其ΔA532值，再根据标准工作曲线算得原样中嘌呤含量，结果见表1。

表1 谷物及其制品中嘌呤含量测定结果(n=5)

从表1可知，实验建立的方法有良好的精密度，其相对标准偏差(RSD)均小于8%。其中鸟嘌呤的RSD比总嘌呤的略大，原因是鸟嘌呤含量较低所致;另外，本法和HPLC法的RSD分别为2.2% ～7.3%、2.2%～7.5%，可见本法的精密度与HPLC法一致，这是两种方法测定的稳定性相当且都有较高的结果。本法的回收率为 83.8% ～98.1% (平均91.9%)，与曲欣等［11］用 HPLC 法回收率达 91.8%相一致，符合微量组分分析要求。同时，经F－检验和t－检验也都表明本法与HPLC法无统计学上差异(P=0.05)。显然本法利用氯醌酸与嘌呤的荷移反应光度的方法测定谷物中的嘌呤含量其精密度和准确性均与HPLC法相当，这也表明氯醌酸荷移光度法测定谷物中的嘌呤含量可行。

3 结论

以氯醌酸为荷移剂的光度法测定嘌呤含量的实验得到其最优反应条件为:室温(20～30℃)、pH中性、以无水乙醇为介质、控制测定体系水分2.5% ～3.0%、反应5 ～30 min，能得到 n氯醌酸∶n鸟嘌呤=1 ∶3的紫红色稳定荷移络合物;在λmax=532 nm下，鸟嘌呤和混合总嘌呤的浓度在0～1×10－4mol·L－1范围内符合朗伯－比耳定律且有良好的线性关系，其线性方程分别为 ΔA鸟嘌呤=0.034c鸟嘌呤+0.005(R2=0.995 2)、ΔA总嘌呤=0.028 5c总嘌呤+0.007 1(R2=0.992)，其摩尔吸光系数分别为ε鸟嘌呤=3.1×104L·mol－1·cm－1、ε总嘌呤=3.6 ×104L·mol－1·cm－1，检出限分别为 2 ×10－6mol·L－1、9 ×10－6mol·L－1。而对谷物实样的测得结果显示本实验所建立方法有良好的精密度(RSD2.2% ～7.3%)且与HPLC法(RSD2.2% ～7.5%)相一致，回收率为83.8% ～98.1%与 HPLC法≥91.8%相当，符合 GB/T 27417—2017对微量成分分析的要求，获得了满意的结果。可见氯醌酸荷移光度法测定谷物中的嘌呤含量可行，而且本法易操作、速度快、成本低，是一种具有发展前景的测定食品嘌呤的方法。