响应面法优化超声辅助离子液体提取黑豆异黄酮及其抗氧化活性研究

苏 适 赵东江 王喜庆 迟彩霞 王 斌

(绥化学院食品与制药工程学院，绥化 152061)

黑豆为豆科植物大豆的干燥种子，味甘性平，含有不饱和脂肪酸、蛋白质、异黄酮、多种微量元素等多种营养成分[1]，其中的异黄酮具有防治中老年骨质疏松症、抗衰老、抗氧化、降低胆固醇等多种功效[2]。黑豆与普通大豆成分类似，但黑豆中的类黄酮化合物含量比普通大豆高5以上倍[3]。黑豆异黄酮还能有效抑制结肠癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤[4]，比黄豆有更高的医药价值和开发前景。

超声提取法在中草药的提取中应用较多，利用超声波的空化效应和机械效应，破坏植物组织细胞[5]，将植物中的化学成分快速提取，具有操作简单方便，提取液杂质少等特点。离子液体(ionic liquid)在室温下完全由离子组成的液体物质[6]。离子液体可用于超声辅助提取天然产物，具有理化性质稳定、萃取能力好、可重复利用等特殊性质。陈明明等[7]采用离子液体辅助超声提取黄柏中的总生物碱，优化了提取工艺，与传统工艺相比，具有环境污染小，溶剂可重复使用，提取率达到 5.35%。张喜峰等[8]采用离子液体超声辅助提取桑葚中的原花青素，扫描电镜观察，此方法对桑葚粉末微观结构破坏影响较大，在此条件下获得桑葚中原花青素得率为3.51%，而超声辅助提取得率仅为 2.46%。钟方丽[9]等研究了采用离子液体超声辅助提取香叶中总黄酮，与传统超声辅助醇提工艺相比，总黄酮提取率提高了45.46%。采用离子液体-超声辅助提取黑豆中异黄酮的研究鲜见报道，因此，本实验采用此方法研究黑豆异黄酮的提取工艺，同时，研究异黄酮的抗氧化活性，为深入研究其生物活性及保健药物的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青仁黑豆，产地：黑龙江省。

金雀异黄酮标准品(纯度 98%)；1-丁基-3-甲基咪唑溴盐(纯度 98%)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；抗坏血酸；无水乙醇；所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-50B超声波清洗器；101C-2B电热鼓风干燥箱；XV-9200紫外分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线

准确称取金雀异黄酮标准品1.0 mg，用95%的乙醇溶液配制成浓度为 1 mg/mL的标准溶液，分别移取 0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 的标准溶液，置于10 mL的容量瓶定容，在 260 nm 处测定吸光度。以金雀异黄酮的浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程y=0.112 6x，R2=0.997 9。

1.3.2 黑豆异黄酮的提取

黑豆粉碎→过60目筛→按照料液比1 ∶3 加入正己烷，脱脂 2 次→离子液体-超声提取→提取液离心→测定异黄酮含量。

1.3.3 提取率计算

量取2.0 g已脱脂黑豆粉，加入一定浓度的离子液体，在一定条件下采用超声波辅助提取黑豆异黄酮，以5 000 r/min 离心30 min，得到滤液，按1.3.1项下方法测定其吸光度，并根据回归方程，计算黑豆异黄酮浓度及提取率。

式中：C为测得质量浓度/μg/mL；V为定容体积/mL；n为稀释倍数；M为原料质量/g。

1.4 提取工艺优化

准确称取已脱脂的黑豆粉末2.0 g，采用离子液体-超声辅助法提取黑豆异黄酮，考察离子液体浓度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L)、提取温度(20、30、40、50、60、70 ℃)、料液比(1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35)、超声时间(10、20、30、40、50、60 min)对黑豆异黄酮提取率的影响。

1.5 响应面实验设计

根据单因素实验，选取离子液体浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)、提取温度(D)，黑豆异黄酮收率为响应值，根据Box-Behnken Design中心组合设计原理，优化黑豆异黄酮提取工艺，以异黄酮的提取率为响应值，建立响应回归模型，因素水平见表1。

表1 响应面试验设计

1.6 黑豆异黄酮抗氧化活性测定

1.6.1 黑豆异黄酮对羟自由基清除能力的测定

黑豆异黄酮及VC对羟基自由基的清除率，采用水杨酸法进行测定。对黑豆异黄酮羟自由基的清除能力进行测定，VC做阳性对照，A0为空白对照液的吸光值；A1为分别加黑豆异黄酮及 VC 后的吸光值；A2为不加 H2O2时的吸光值，计算清除率。

1.6.2 黑豆异黄酮对DPPH·清除能力的测定

测定黑豆异黄酮对DPPH·自由基清除率。DPPH·清除率与抗氧化能力呈正相关。分别量取 0.05，0.10、 0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的黑豆异黄酮提取液和 0.1 mol/mL DPPH·溶液各2 mL，混合置于10 mL 比色管中，60% 乙醇定容至刻度，在室温条件下暗处放置30 min，测其吸光度值为 260 nm作为Am；用乙醇溶液分别代替DPPH·和黑豆异黄酮提取液，同法测定其吸光度分别为An和Ak，计算清除率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取时间对提取率的影响

由图1可知，随提取时间的不断增长，异黄酮提取率呈现增长趋势，提取时间为40 min时，提取率达到最大值，但时间超过40 min，提取率开始降低。随着超声时间延长，通过超声波空化作用和机械震动的持续作用，提取成分逐渐溶出，提取率逐渐升高；提取时间过长导致黑豆细胞组织中大量细胞破裂，同增加其他杂质的溶出。因此，超声时间选择40 min。

2.1.2 离子液体浓度对提取率的影响

由图1可知，随离子液体[Bmim]Br 浓度的增加，异黄酮的提取率逐渐增加，当[Bmim]Br 浓度为 0.8 mol/L 时，异黄酮提取率达到最大值，但随着离子液体浓度超过 0.8 mol/L，提取率略有下降。原因可能是与提取溶剂的黏度相关，离子液体的浓度过高，提取液黏度也会继续增大，溶液扩散能力变差，更难渗到黑豆细胞的内部，使得[Bmim]Br对黑豆异黄酮的溶出能力降低。因此，选择离子液体[Bmim]Br 浓度为 0.8 mol/L。

2.1.3 料液比对提取率的影响

由图1可知，随着料液比的增长，异黄酮提取率逐渐增大，料液比为1 ∶25(g/mL)时，达到最大值，但料液比超过1 ∶25(g/mL)，提取率开始下降。随着料液比的增大，黑豆粉末在溶液中的分散程度增大，与提取剂的接触面积增大，有利于溶出；但大量溶剂会吸收一定的超声波，降低了超声波对细胞的破碎能力，导致细胞内异黄酮溶出减少。因此，料液比选择1 ∶25(g/mL)。

2.1.4 提取温度对提取率的影响

由图1可知，随着温度升高，异黄酮提取率逐渐增大，当温度为50 ℃时，提取率最大，继续升温，提取率下降。可能是随着温度升高，离子液体的运动速率和频率增大，更易渗透到黑豆组织细胞，加速异黄酮的溶出。但继续升温，使异黄酮结构上的酚羟基发生氧化；随着温度升高，细胞中其他内容物溶出增多，溶液黏度增大，影响异黄酮溶出，提取率下降。所以，选择提取温度50 ℃。

图1 提取时间、离子液体浓度、液料比和提取温度对异黄酮提取率的影响

2.2 响应面结果分析

2.2.1 响应面设计及结果

采用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据分析，得到二次回归拟合方程Y=+0.42+7.833×10-3A+3.750×10-3B+7.917×10-3C-1.500×10-3D-7.50×10-3AB+2.500×10-4AC-2.500×10-3AD-3.000×10-3BC+3.000×10-3BD-1.500×10-3CD-0.036A2-0.016B2-0.011C2-0.020D2

表2 响应面实验设计方案

表3 方差分析表

注:P>0.05为不显著；P<0.05为显著；P<0.01为极显著。

2.2.2 响应面分析

响应曲面图可以显著反映各因素之间相互作用的强弱，采用Box-Behnken 软件进行分析。响应曲面越陡峭，则表明该因素对异黄酮得率的影响越大，响应值对于操作条件的改变越敏感；反之，曲面越平缓则影响越小；等高线越接近于椭圆形两因素交互影响越大，越接近于圆形交互影响越小。离子液体浓度与提取时间、料液比、提取温度之间交互作用对提取率的影响极显著，曲线较陡；响应曲线平缓可知，提取时间与料液比、提取时间与提取温度、料液比与提取温度的交互作用对提取率的影响不显著，表现为曲线较为平滑，响应值无显著性变化。

2.2.3 验证实验

结合单因素实验，分析回归模型，经过验证，最终得出该提取方法准确可靠。黑豆异黄酮的最佳提取条件：离子液体浓度0.76 mol/L，提取时间41.56 min，料液比1 ∶23.70，提取温度48.94 ℃，理论预计值0.422%。结合实验实际情况，最终选择离子液体浓度0.75 mol/L，提取时间40 min，料液比1 ∶23，提取温度50 ℃，进行5次平行实验，得到异黄酮提取率平均值为0.419%，与预测值接近，验证了此模型的有效性，说明预测模型与实际情况拟合较好。

2.3 黑豆异黄酮的抗氧化活性分析

2.3.1 对DPPH·自由基清除率测定

由图2可知，在一定范围内，随着浓度的增加黑豆异黄酮和VC对羟基自由基清除率均逐渐增强，说明二者对羟基自由基的清除能力均存在着一定的量效关系。结果表明，黑豆异黄酮对DPPH·有很大的清除力。

图2 对DPPH·的清除作用

2.3.2 黑豆异黄酮对·OH的清除能力

VC和大豆异黄酮对·OH的清除能力，结果见图3。由图3可见，黑豆异黄酮对·OH有一定的清除能力，且随着异黄酮质量浓度的增大，其清除能力也不断增强。异黄酮在实验的质量浓度范围内对·OH的清除能力要高于VC。

图3 对·OH清除作用

3 离子液体的回收

由于[Bmim]Br离子液体的密度大，沸点高，提取后的离子液体中加入与其不互溶的乙酸乙酯来分离异黄酮、分离出与乙酸乙酯不互溶的离子液体，再减压蒸馏蒸除水分，再在真空烘干箱中65 ℃烘干，将分离出的离子液体进吸光度测定，回收的离子液体吸光度值与未使用过的离子液体吸光度值接近。采用回收的[Bmim]Br离子液体进行重复提取，进行 3 次平行试验，提取率达到首次提取率的92.55%，因此，溶剂可再重复利用。

4 结论

本研究采用离子液体-超声辅助提取法，对黑豆异黄酮的提取工艺进行了研究。根据响应面法优化提取工艺，得到最佳工艺条件为：离子液体浓度为0.75 mol/L、料液比 1 ∶23(g/mL)、提取温度50 ℃、超声时间 40 min，进行5次平行试验；在此条件下黑豆异黄酮的提取率可达0.419%。离子液体的极性可控，可以对中药中的复杂成分进行选择性提取，与传统提取工艺相比，该提取工艺时间短，所需溶剂少，离子液体可重复利用。

黑豆异黄酮抗氧化性能结果表明，异黄酮具有较强的抗氧化活性，在一定质量浓度范围内，随样品质量浓度的增加，其抗氧化性能也不断提高；其清除羟自由基的能力高于VC，当质量浓度高于100 mg/mL时，对DPPH·清除率高于VC。本实验采用离子液体超声辅助提取黑豆中异黄酮，获得较优提取工艺参数，可为黑豆深层次开发提供参考，是一种快速高效提取黑豆异黄酮的理想方法。