超临界CO2夹带乙醇萃取裂殖壶藻油脂的工艺研究

李佩雷 李红娜 敬科举 林洁茹 Andreea David 邓 刚

(浙江师范大学化学与生命科学院1，金华 321004) (厦门大学化学化工学院2，厦门 361005)

裂殖壶藻(Schizochytriumsp.)是一种常见的微藻，其生长周期远低于动物，因此通过发酵调控非常易于规模化培养[1]，发酵后的藻细胞中总油脂质量分数可高于70%[2]，其中ω-3长链多不饱和脂肪酸特别是二十二碳六烯酸(DHA)质量分数约为总油脂的30%～50%[3-4]，是一种理想的可替代深海鱼油的DHA生产原料。随着我国节能减排政策的推行及深化，相关环境友好的油脂绿色提取技术已成为研发热点。其中，超临界二氧化碳(scCO2)萃取工艺因其高压、低温、隔氧的操作环境，非常适用于提取易氧化、热敏性的低极性脂类物质[5]，与传统的有机溶剂提取工艺相比，不存在毒性成分残留问题[6]，已在微生物油脂生产加工领域显现出一定的优势及应用前景[7-8]。

然而，裂殖壶藻细胞中，90%以上的油脂是以甘油三酯的形式存在[9]，其分子电荷排布均匀，属于中极性脂，并含有少量的磷脂、糖脂等极性油脂[10]。显然，对中性脂的提取而言，纯超临界CO2并不是理想的选择，一些研究结合使用极性的助溶剂对其进行了改性。唐韶坤等[11]在裂殖壶藻原料中加入了等质量的95%乙醇，先进行了超声波预处理，然后再用超临界CO2进行萃取，油脂回收率由原来的29.2%提高到75.5%；Wang等[12]则用亚临界状态的CO2对乙醇进行膨胀(CO2摩尔比约为0.2)，用此类加压流体从裂殖壶藻中提取了油脂，虽然最终油脂回收率可达87.0%，但整体工艺乙醇用量过大，减压回收溶剂成本偏高。本研究拟采用超临界二氧化碳夹带乙醇流体从裂殖壶藻细胞中提取富含DHA的微生物油脂，有关这方面研究鲜见报道。根据二氧化碳-乙醇气液相平衡性质确定了夹带剂的加量范围；对提取过程进行了动力学分析，设计响应面试验优化了温度、压力、乙醇摩尔比等工艺条件；利用Peng-Robinson方程计算了混合流体密度，部分解释了主要因素对油脂回收率的影响；最后通过气相色谱测定了微藻油脂的脂肪酸组成及DHA含量，并与其他工艺进行对比分析，综合评估了新工艺的特点及可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

裂殖壶藻(Schizochytriumsp.)：菌种由浙江师范大学菌种保藏中心保藏，经谷氨酸钠固体培养基活化，30 ℃摇瓶培养2～3 d，转接至5 L种子罐进行扩培，最后转接至50 L机械罐进行发酵培养，接种量10%，培养温度28 ℃，自动控制pH 6.5，通气量为2 vvm，发酵时间约为4～5 d，发酵终止时残糖浓度降至约5 g/L。发酵液在4 ℃，8 000 r/min的条件下，离心15 min，收集微藻细胞，经冷冻干燥后，研磨成粉。

1.2 仪器与试剂

FMG-5L和FUS-50L(A)机械发酵罐；HELIX超临界天然产物萃取系统；K-501双活塞往复泵；GC 7890A气相色谱仪；BSA224S电子天平。

CO2气体(纯度≥99.9%)；甲苯、甲醇为色谱纯；脂肪酸甲酯混合标准品、正己烷、乙醇等均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 微藻油脂提取方法

有机溶剂提取：称取20.0 g微藻干粉，以正己烷为溶剂，采用索氏提取法，在80 ℃下抽提3 h。提取结束后，通过旋转蒸发除去正己烷，称重，试验重复3次。一般而言，有机溶剂提取可视为微藻油脂的完全提取方法，为便于比较工艺，本研究定义了油脂回收率，即各工艺提取得到的油脂质量占有机溶剂提取得到的总油脂质量的百分比。

超临界CO2夹带乙醇提取：称取20.0 g微藻干粉，与等体积玻璃珠混合，置于萃取釜，分别设置萃取釜和分离釜的温度和压力，由双活塞往复泵精准控制夹带剂乙醇的流速。提取过程中，每隔30 min取样，称重并计算油脂回收率。CO2流速保持在5 L/min，纯超临界CO2提取采用以上相同的装置。

1.3.2 夹带剂乙醇加入量的确定

图1 CO2-乙醇气液相平衡图(323 K)

根据文献查阅得到的热力学数据[13，14]，绘制了323 K下CO2-乙醇气液相平衡图，如图1所示。在此温度下，超临界CO2夹带乙醇的操作压力应大于临界压力(Pc，9.05 MPa)，而对应的二氧化碳摩尔比应大于其临界摩尔比(xc，0.93 mol/mol)，由此可确定夹带剂乙醇的摩尔比应控制在0～0.07的范围内。以此类推，进一步查阅了313～333 K下的气液相平衡数据，最终确定实验中乙醇摩尔比参考范围为0～0.09。

1.3.3 响应面优化试验设计

对油脂提取过程进行动力学分析，由预试验结果确定优化试验所需的提取时间，采用Design Expert 8.0软件，根据中心组合设计(CCD)进行响应面优化试验，响应面优化试验的因素及水平见表1。

表1 响应面优化试验的因素及水平

1.3.4 微藻油脂肪酸组成及含量测定

甲酯化：采用Cavonius等[15]的方法，略加修改。称取100 mg样品，溶于2.5 mL甲苯，加入3 mL体积分数为10%的乙酰氯甲醇溶液，在氮气保护下，80 ℃反应2 h。冷却后，加入4.5 mL 6%碳酸钠溶液。5 000 r/min离心5 min，取有机相，进行气相色谱分析。

气相色谱条件：毛细管分析柱为Agilent HP-5,30 m×0.32 mm×0.25 μm；载气为高纯氮气(纯度>99.99%)，流速为30 mL/min；进样口、检测器温度分别为270、280 ℃，进样量为1 μL，分流比100 ∶1。采用程序升温：初始温度为100 ℃，保持13 min，然后以10 ℃/min升温至180 ℃，保持 6 min，再以1 ℃/min升温至200 ℃，保持20 min，最后以4 ℃/min升温至230 ℃，保持10.5 min。根据脂肪酸甲酯混合标准品确定样品中的脂肪酸种类，采用面积归一法计算脂肪酸相对含量，每个样品重复测定3次[16]。

1.4 超临界CO2夹带乙醇流体密度估算

超临界CO2夹带乙醇流体的密度可用Peng-Robinson方程计算[17，18]。

(1)

(2)

式中：P为压力/Pa；R为理想气体常数/8.314 J/(mol·K)；T为温度/K；Vm为摩尔体积/m3/mol；a为分子间引力，是关于温度的函数；b为气体总体积中包含分子本身体积的部分，是与临界温度和临界压力相关的常数。ρ为流体密度/kg/m3；xCO2、xEtOH分别为CO2、乙醇的摩尔比；MCO2、MEtOH分别为CO2、乙醇的相对分子质量/g/mol。

2 结果与讨论

2.1 提取过程的动力学分析

在优化试验前，根据预实验结果，选取了温度(40～60 ℃)、压力(25～45 MPa)、乙醇摩尔比(0～0.09)的边界值作为操作条件，分别绘制了超临界CO2夹带乙醇萃取裂殖壶藻油脂的提取过程曲线，如图2所示。超临界CO2夹带乙醇流体提微藻油脂的动态过程大致分为以下3个阶段[19]：1)恒定提取速率期(Constant-extraction rate period, CER)，油脂回收率以相对恒定的速率快速增加；2)减速提取期(Falling-extraction rate period, FER)，油脂提取速率减慢，但回收率仍在明显增加；3)扩散控制提取期(Diffusion-controlled rate period, DCR)，油脂回收率以极缓慢的速率增加。尽管不同操作条件下，微藻油脂的提取速率各不相同，但提取3 h后均能进入扩散控制期，即可达到操作条件下最大油脂回收率。后续优化试验的提取时间设定为3 h，事实上由于每批次提取试验CO2的流速是恒定的(即乙醇摩尔比仅取决于乙醇泵入的流速)，因此也意味着每批次试验的CO2用量恒定。

图2 超临界CO2夹带乙醇萃取裂殖壶藻油脂的提取过程曲线

2.2 中心组合试验结果及响应面模型

基于中心组合设计原理，进行了响应面试验，并在各操作条件下计算了流体的密度，响应面中心组合实验设计及结果见表2。对试验值进行了多元线性回归分析，拟合得到了二阶多项式方程如下：

表2 响应面中心组合实验设计及结果

表3 超临界CO2夹带乙醇萃取裂殖壶藻油脂的方差分析

2.3 操作压力及温度对微藻油脂提取的影响

温度和压力对裂殖壶藻油脂回收率的影响如图3所示。在乙醇摩尔比为0.04的条件下，考察了温度和压力对超临界CO2夹带乙醇萃取裂殖壶藻油脂的影响。图3a表明温度为50 ℃时，随着压力增加，油脂回收率先增大后减小，当压力约为38 MPa时，油脂回收率达到最大值85.5%。图3b表明当压力从25 MPa增大至38 MPa时，流体密度从846 kg/m3逐渐增大至935 kg/m3，溶剂化效应增强，有利于油脂溶解度的增加[20]，但压力达到38 MPa后继续增加，油脂回收率反而减少，原因可能是过高的压力降低了物料的孔隙率，使流体难以扩散进入物料的孔状结构内部，增加了传质的阻力[21]。此外，在相同操作压力35 MPa下，升高提取温度也可以引起油脂回收率先增大后减小，如图3a所示。温度的升高一方面可以增大溶质的蒸气压，增加微藻油脂的溶解度；另一方面也会降低流体密度，使溶剂化效应减弱，阻碍油脂的提取[22]。两方面效应存在竞争关系，在40～52 ℃范围内，蒸气压效应占主导地位，油脂回收率从54.3%增大至最大值84.9%；在52～60 ℃范围内，则受溶剂化效应控制，油脂回收率从最大值降至69.0%。

图3 温度和压力对裂殖壶藻油脂回收率的影响

2.4 夹带剂对微藻油脂得率的影响

乙醇摩尔比和压力对裂殖壶藻油脂回收率的影响如图4所示。夹带剂在超临界CO2流体萃取中作用机制尚存在很多争议，最新基于统计热力学理论的研究[23]认为夹带剂与溶质之间的相互作用对溶解度的增加起主导作用，而其他效应如压力变化引起的流体密度的增加、CO2及夹带剂分子的簇集作用所引起的溶剂化效应，可忽略不计。图5a和图5b分别显示了在超临界CO2夹带乙醇流体的操作区域内油脂回收率关于乙醇摩尔比、压力的响应面图及等高线图。由图可知，当压力为35 MPa时，乙醇摩尔比由0增至0.04时，油脂回收率从71.6%增大到最大值84.3%，上升阶段夹带剂对油脂的增溶作用明显；然而，当流体中乙醇的摩尔比继续增大，则会导致流体总体极性过高，偏离了甘油三酯等中性油脂的极性范围，油脂回收率反而降低，在乙醇摩尔比为0.09的条件下，油脂回收率仅为68.6%。

图4 乙醇摩尔比和压力对裂殖壶藻油脂回收率的影响

2.5 优化结果及验证试验

回归模型的分析结果显示，超临界CO2夹带乙醇流体提取微藻油脂的最佳条件为：温度51.51 ℃、压力37.64 MPa、乙醇摩尔比0.04，在此条件下，微藻油脂回收率的预测值为86.0%。考虑到实际操作的可行性，验证试验所采用的工艺条件为：温度52 ℃、压力38 MPa、乙醇摩尔比0.04，3组平行试验的平均回收率为(88.2±0.5)%，与预测值基本相符，证明了在操作范围内模型拟合程度良好。传统的有机溶剂提取法可从20 g微藻中提取到4.98 g油脂，环境友好型的超临界CO2夹带乙醇流体萃取的油脂回收率接近90%，显著高于相同温度、压力条件下纯超临界CO2提取的油脂回收率(71.9%)，表明了夹带剂乙醇加入后，超临界CO2流体对裂殖壶藻油脂具有明显的增溶作用。

2.6 不同工艺条件下脂肪酸组成的对比分析

不同工艺条件下裂殖壶藻油脂的脂肪酸组成见表4，表中显示了新工艺得到的微藻油脂的脂肪酸组成，并与纯超临界CO2流体及传统有机溶剂提取工艺进行了对比研究。从脂肪酸组成分析结果来看，超临界CO2夹带乙醇流体提取得到的微藻油脂，完全可以达到传统提取工艺的产品要求。作为DHA的生产原料，新工艺得到的裂殖壶藻油脂的DHA质量分数约为39.9%，高于纯超临界CO2流体及正己烷提取得到的油脂中的含量，这可能是因为夹带剂乙醇的加入，一定程度上增大了流体的极性，从而更易提取得到DHA含量更高的极性磷脂[9]。超临界CO2夹带乙醇流体提取到的裂殖壶藻油脂中，总不饱和脂肪酸质量分数超过50%，相应的饱和脂肪酸比例略低于传统工艺，属于高品质的微生物油脂，主要可用于DHA的生产，以软脂酸为主的副产物亦可用于其他油脂产品的生产。

表4 不同工艺条件下裂殖壶藻油脂的脂肪酸组成

3 结论

本研究采用超临界CO2夹带乙醇流体，从裂殖壶藻中提取油脂，通过中心组合设计试验构建了响应面方程，经优化得到了最佳工艺条件：温度52 ℃，压力38 MPa，乙醇摩尔比0.04；在此条件下，微藻油脂回收率为88.2%，显著高于纯超临界CO2萃取的回收率(71.9%)。结合构建的模型方程，以及通过Peng-Robinson方程计算得到的混合流体密度，部分解释了温度、压力、乙醇摩尔比对油脂回收率的影响。夹带剂乙醇的加入可将超临界流体的极性范围从低极性调整至中等极性，有利于富含DHA的中性微藻油脂的提取。气相色谱对微藻油脂的化学组成分析结果表明，使用乙醇夹带剂后，油脂中的DHA含量高于传统工艺。由此可见，超临界CO2夹带乙醇流体萃取作为一种新型的、环境友好的绿色工艺，非常适用于富含多不饱和脂肪酸微藻油脂的提取，具有良好的应用前景。