壶瓶碎米荠粗黄酮产品抗氧化研究

张春燕 唐巧玉 周毅峰，4

(生物资源保护与利用湖北省重点实验室1，恩施 445000) (湖北民族学院林学园艺学院2，恩施 445000) (湖北省来凤县高级中学3，来凤 445700) (湖北民族学院生物科学与技术4，恩施 445000)

机体的衰老和疾病大多数与体内的自由基有关，机体脂褐素的积累、组织细胞的破坏与衰减、免疫功能的降低、动脉粥氧化、脑血栓、脑损伤甚至癌症的发生均与自由基的活动有密切关系[1-2]。人体中有一套清除自由基的特殊系统，但该系统的清除能力会随着人年龄增长和体质下降而减弱，自由基的积累也逐步增加；在外界自由基大量侵入或因机体年老等原因导致自身自由基清除能力降低的情况下可补充抗氧化药物进行辅助[3]。抗氧化药物能与自由基进行结合反应，通过提供自由基所需电子来终止电子争夺链式反应使其形成稳定状态。

植物黄酮类物质是强力的天然抗氧化物质，独特的生理结构使之具有较强的清除自由基能力，目前已被证实藤茶、银杏、薄荷、首乌藤等的黄酮均有很强的抗氧化效果[4]。大量研究显示，有机硒与无机硒均有较强的抗氧化活性，且有机硒的作用效果比无机硒更为显著[5-6]。恩施所产的壶瓶碎米荠聚硒量平均在239～380 μg/g干重，其聚硒能力达到了目前所发现的聚硒植物的最高标准[7]，且已经有基因组研究表明，植物黄酮具有硒化的可能[8]。本研究以普通种植的壶瓶碎米荠与外源硒栽培的壶瓶碎米荠所提取的粗黄酮为材料，采用体外自由基清除法与小鼠体内抗氧化来考察抗氧化效果，以期为富硒壶瓶碎米荠的深度开发提供参考，为天然抗氧化药物提供潜在资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 壶瓶碎米荠种植材料

一般种植壶瓶碎米荠：于湖北省重点实验室温室内进行水培，施以全霍格兰德营养液，生长时间90 d。

外源硒种植壶瓶碎米荠：于湖北省重点实验室温室内进行水培，施以全霍格兰德营养液，以亚硒酸钠为外源硒肥，按硒质量浓度为45 mg/L加入水培箱中，每周1次，连续施加4周，生长时间90 d[9]。

1.1.2 实验动物

8周龄昆明种小鼠102只，体重(20±2) g，实验动物合格证号：XSD2017110011。

1.1.3 实验试剂

芦丁、无水乙醇、抗坏血酸、邻苯三酚、无水醋酸钠、磷酸二氢钾、邻二氮菲、冰乙酸、双氧水、TPTZ、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷、硝酸钠、硝酸铝、七水合硫酸亚铁、六水合氯化铁均为分析纯。SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、CAT试剂盒、MDA试剂盒。

1.1.4 实验仪器

TU-1810紫外可见分光光度计；4510 原子吸收光谱仪；TU-1901 双光束紫外可见分光光度计；AFS-930 d 原子荧光光谱仪；DFY-500摇摆式高速万能粉碎机； TG16B台式高速离心机；GZXGF-9053A智能型鼓风干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 制取壶瓶碎米荠粗黄酮产品

将采集的两种材料分别在60 ℃恒温烘干，粉碎，石油醚浸泡2 d进行脱脂处理，浸泡后滤掉石油醚并烘干，50 ℃低温水提，离心清除蛋白质。清除蛋白质后高温乙醇提取，将提取液合并减压浓缩。浓缩液用四倍体积95%的乙醇溶解，滤掉沉淀物取上清液减压浓缩，60 ℃恒温烘干即得两种材料粗黄酮产品(下文简称含硒粗黄酮与粗黄酮)。以芦丁为标准品采用铝盐显色法测两种粗黄酮产品中黄酮含量，采用原子荧光法测两种粗黄酮产品中硒含量[10]。

1.2.2 黄酮含量测定

配制质量浓度0.5 mg/mL的芦丁标准溶液。取7试管，编号0～6，按照下表加入相应试剂用后55%乙醇定容至10 mL，摇匀后静置10 min，用0号管作为对照测OD510值，测得标准曲线为y=0.005x-0.003，R2=0.999 2。黄酮标准曲线的制作见表1[11]。

表1 黄酮标准曲线的制作

注:*表示需摇匀、静置6 min。

样品含量按照公式计算：

样品含量=C×V×N/m

式中：C为测得样品溶液中的质量浓度/mg/mL；V为样品溶液的最终稀释体积/mL；N为稀释倍数；m为材料质量/g[11]。

1.2.3 硒含量测定

将洗净的消解管、25 mL以及100 mL容量瓶、10 mL离心管、小烧杯、玻璃棒等放入酸缸(里面为20%的HNO3)中浸泡过夜，取出清洗后，用超纯水润洗，放入烘箱中烘干备用[9]。

用移液枪吸取0.5 mL样品，加入到消解管，做3个平行，同时设立一组样品空白对照。各消解管中加入2 mL过氧化氢，微波消解仪180 ℃消解30 min。将消解管按顺序取出后于每管加入12 mol/L的HCl 5 mL，再放入微波消解仪中用180 ℃消解1 h，将消解管中的液体转入对应编号的10 mL容量瓶，超纯水定容到 10 mL振荡均匀。

通过氢化物发生-原子荧光光谱法测定已经处理好的样品。配置标准系列、载流以及还原剂，标准系列配置见表2。回归方程为：y=12.9x-50.8，R2=0.998 1。

表2 标准系列配置

1.2.4 两种粗黄酮体外抗氧化实验

羟自由基清除能力的测定：精确配制0.5 mg/mL粗黄酮、0.5 mg/mL含硒粗黄酮、0.5 mg/mL芦丁以及0.5 mg/mL抗坏血酸。测定采用邻二氮菲法进行测定[12]，每组做3个重复。摇匀后，37 ℃水浴60 min，用空白管做对照，在536 nm下测吸光度值。

超氧阴离子自由基清除能力测定[13]：用邻苯三酚自氧化法进行测定，每组做3个重复，反应5 min后加浓盐酸终止反应，在325 nm下测定各管的吸光值。

DPPH自由基清除能力测定[14]：分别配制0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mg/mL粗黄酮提取液、含硒粗黄酮提取液、芦丁溶液、VC溶液以及0.1 mmol/L的DPPH溶液。调整样品浓度，分别在不同浓度1mL样品溶液中分别加入1 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，室温避光反应30 min，517 nm测定吸光值。

清除率计算：清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%，其中A0为对照值，A1为测定值，A2为样品在体系中的吸光值[14]。

总抗氧化能力测定：分别配制0.1 mg/mL含硒粗黄酮提取液、0.1 mg/mL芦丁溶液、0.1 mg/mL VC溶液。在试管中先加入0.1 mL样品，再加入2.4mLFRAP工作液，37 ℃条件下水浴20 min，于593 nm处测定吸光度[15]。

1.2.5 两种粗黄酮小鼠体内抗氧化实验

分组及处理：先将小鼠进行适应性喂养2周，后将102只小鼠分为17组饲养，分组为对照组L0，粗黄酮处理组A；含硒粗黄酮处理组B；阳性对照VC组C；阳性对照芦丁组D。饲养过程中保证饲料与纯水充足，先适应喂养2周后开始进行处理。每天固定时间灌胃1次，每次给药1 mL。连续给药4周，实验期间正常饮食，注意观测，4周后实验结束。处理浓度见表3[6]。

表3 处理浓度

指标测定：小鼠连续连续给药4周后禁食1 d，断头取血。血样于4 ℃的冰箱中静置后，在离心机中以4 000 r/min的转速离心20 min，取上清液，分别按照SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒说明书方法测定血清中SOD活性、和GSH-Px活力与MDA含量[16-18]。

1.3 数据分析

所有实验重复3次，采用SPSS 17.0、ORIGIN8.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 粗黄酮含量及硒含量

壶瓶碎米荠粗纯物中黄酮含量及硒含量见表4。由表4可得，含硒壶瓶碎米荠粗纯物黄酮含量为71.22%，一般种植材料粗纯物的黄酮含量为73.84%，粗纯物中黄酮含量较高，在一定程度上能反映出黄酮的特性；本实验所提取的含硒粗黄酮中的硒含量为9.26 μg/g，显著高于普通种植材料，说明硒元素能结合到黄酮中。

表4 粗纯物中黄酮及硒的含量

注:同列字母不同表示具有显著性差异(P<0.05),下同。

2.2 羟自由基的清除率

利用邻二氮菲能与Fe2+形成络合物，H2O2与Fe2+通过Fenton反应产生羟自由基可将Fe2+氧化为Fe3+，根据抗氧化物质还原Fe2+的多少，计算样品的抗氧化能力的大小。

根据预实验，确定测试粗黄酮的含量为0.5 mg/mL，配制同样浓度的含硒粗黄酮、芦丁标准品和抗坏血酸标准品作为对比，实验发现，当加入0.2 mL样液进行检测时，两种粗黄酮和芦丁的清除率接近，能够达到40%左右，而抗坏血酸的清除率趋近于零；当加入0.4 mL样液时，两种粗黄酮和芦丁的清除率均高于60%；当加入0.6 mL样液时，两种粗黄酮和芦丁的清除率趋近于80%，基本达到峰值，而VC的清除率仍然小于10%，实验发现，当VC含量含量增加二十倍时，才能够达到与之相同的效果，侧面说明壶瓶碎米荠两种粗黄酮的抗氧化活性约为VC的二十倍。实验中两种粗黄酮的IC50低于0.02 mg，远低于其他植物中黄酮的含量，说明碎米荠含硒粗黄酮的抗氧化活性非常高。两种粗黄酮的整体趋势与芦丁基本一致，显著高于VC；含硒粗黄酮在高浓度时和普通粗黄酮达到显著性差异(P<0.05)。羟自由基清除率如图1所示。

图1 羟自由基清除率注：字母不同表示同一浓度范围内实验组具有显著性差异(P<0.05)，下同。

2.3 超氧阴离子清除率

本实验采用邻苯三酚自氧化法，在碱性条件下邻苯淡粉能够迅速自氧化，释放出超氧阴离子自由基，生成中间物质，在420 nm下有强烈吸收峰。在加入邻苯三酚后，一般在4 min的范围内，氧化速率与时间呈线性关系，可计算邻苯三酚的氧化速率。加入抗氧化剂后，邻苯三酚的自氧化受到抑制，根据相对差值计算样品清除率大小。实验结果显示，两种粗黄酮对超氧阴离子有一定的抑制性，且随着浓度的增加呈现正相关关系；在0.025 ～0.3 mg/mL范围内，两种粗黄酮和芦丁对超氧阴离子自由基的清除率显著低于VC，且在质量浓度为0.15 mg/mL时基本反应完全，芦丁最大清除率为30%，壶瓶碎米荠普通粗黄酮最大清除率为35%，壶瓶碎米荠含硒粗黄酮最大清除率为40%。超氧阴离子自由基清除率如图2所示。

图2 超氧阴离子自由基清除率

2.4 DPPH自由基清除率测定

图3 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率如图3所示。由图3可得，两种粗黄酮对DPPH自由基均具有良好的清除作用，两组粗黄酮对DPPH自由基的清除效果基本一致，且在考察的质量浓度范围内，清除率与质量浓度呈现正相关关系；在质量浓度0.04 ～0.24 mg/mL范围内，两种粗黄酮对DPPH的清除率随着浓度的增加逐渐增加，清除效果显著高于芦丁而低于VC；在质量浓度为0.3 mg/mL时，两种粗黄酮对DPPH的清除效果基本与VC持平。

2.5 总抗氧化能力测定

总抗氧化能力的检测采用FRAP法，结果如图4所示。在实验考察的范围内，两种粗黄酮的抗氧化能力均显著高于芦丁(P<0.05)；在质量浓度0.025～0.15 mg/mL范围内，普通粗黄酮与VC总抗氧化能力差异不显著，且显著低于含硒粗黄酮(P<0.05)；在高浓度时(质量浓度为0.25、0.3 mg/mL)两种粗黄酮与VC总抗氧化力基本一致(P>0.05)。

图4 总抗氧化能力

2.6 小鼠体重

由表5可得，处理4周后，壶瓶碎米荠粗黄酮(A组)4个实验处理的体重均高于对照组，且A2与对照达到显著性差异(P<0.05)；壶瓶碎米荠含硒粗黄酮(B组)4个实验处理的体重均高于对照组，且B3组与对照达到显著性差异(P<0.05)；阳性对照VC(C组)4个实验处理的体重均高于对照组；阳性对照芦丁(D组)低浓度处理组(D1、D2)体重高于对照组，高浓度处理组(D3、D4)体重低于对照组，且均未达到显著性差异。

处理4周后实验中A组、B组中小鼠体重均高于对照组，且在喂养过程中小鼠未出现致残、致死等情况，说明壶瓶碎米荠粗黄酮与壶瓶碎米荠含硒粗黄酮对小鼠的生长未造成严重不良影响。

表5 小鼠体重/g

2.7 小鼠血液中抗氧化酶活性

过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)是细胞中清除自由基的主要抗氧化酶，而丙二醛(MDA)是细胞产生的氧化杂质，这几种指标的测定结果能从侧面反映出小鼠的抗氧化效果[19-20]，研究显示，黄酮类物质主要通过调节抗氧化酶的活性从而达到抗氧化的效果[19]。

血清中抗氧化酶活性见表6。由表6得，通过4周的给药处理后对比于正常对照组，实验组(A、B)与阳性对照(C、D)均能提升小鼠血液中的SOD、GSH-Px与CAT活性，且所有实验组中SOD、GSH-Px与对照组相比均达到显著性差异(P<0.05)。

表6 血清中抗氧化酶活性/U/g

壶瓶碎米荠粗黄酮(A组)在25～75 mg/kg范围内使小鼠血液中SOD、GSH-Px与CAT活性逐渐增加，且SOD值在各浓度间达到显著性差异(P<0.05)；质量浓度75～100 mg/kg范围内小鼠血液中SOD、CAT略微下降。

壶瓶碎米荠含硒粗黄酮(B组)在实验组范围内，随着给药浓度的增加均能使小鼠血液中SOD、GSH-Px与CAT活性均逐渐增加，且25 mg/kg与50 mg/kg的实验组三种抗氧化酶的活性均达到显著性差异(P<0.05)。

阳性对照VC(C组)处理组的三种抗氧化酶活性均最高，阳性对照芦丁(D组)处理组3种抗氧化酶的活性的变化趋势与A组类似。

壶瓶碎米荠粗黄酮(A组)处理效果显著低于阳性对照VC(C组)，但与阳性对照芦丁(D组)具有相似的效果，且A1D1、A2D2、A3D4、A4D5间均无显著差异，说明壶瓶碎米荠的黄酮类物质主要成分可能为芦丁。在含硒粗黄酮处理过程中三种抗氧化酶的活性效果呈现良好的递增效应。含硒粗黄酮处理在质量浓度25～50 mg/kg时显著低于C组(P<0.05)；但在75～100 mg/kg时与C组差异不显著，说明壶瓶碎米荠含硒粗黄酮在一定浓度范围内与VC具有相同的抗氧化效果。

2.8 小鼠血液中MDA值含量

血清中MDA含量见表7。由表7可得，通过4周的给药处理后对比于正常对照组，实验组(A、B)与阳性对照(C、D)均能降低小鼠血液中的MDA含量。壶瓶碎米荠粗黄酮(A组)在25～75 mg/kg范围内使小鼠血液中MDA含量逐渐降低，除A1组外均与对照组达到显著性差异。相同处理浓度条件下，MDA含量高于阳性对照组VC(C组)，且A2C2、A3C3、A4C4间均达到显著性差异(P<0.05)；低于阳性对照与芦丁(D组)，且同浓度组间均无显著差异。

壶瓶碎米荠含硒粗黄酮(B组)在实验组范围内，随着给药浓度的增加均能使小鼠血液中MDA含量降低，且与对照组均达到显著差异(P<0.05)。与阳性对照VC(C组)相比，B3组MDA含量低于C3组，B4组MDA含量低于C4组，且差异不显著；与阳性对照芦丁(D组)相比，相同浓度时均低于D组，且B1D1、B2D2、B3D3、B4D4间均达到显著性差异(P<0.05)。

表7 血清中MDA含量

3 结论

壶瓶碎米荠含硒粗黄酮对体外自由基具有一定的清除作用，总体而言两种粗黄酮的抗氧化效果与浓度呈正相关，且抗氧化效果高于芦丁，除超氧阴离子外与VC效果基本一致。含硒粗黄酮的体外抗氧化效果略高于普通粗黄酮，但效果不显著。动物实验中，含硒粗黄酮效果显著高于普通粗黄酮与芦丁，说明硒进入小鼠体内后参与蛋白质及抗氧化酶的合成，故小鼠血液中抗氧化酶的活性增加，对小鼠体质、提高免疫力、自由基清除能力等各方面具有一定的增强效果，故含硒粗黄酮使小鼠的抗氧化效果显著增加。