高大平房仓稻谷粮层霉菌量与优势霉菌的差异性研究

郑云飞 葛志文 刘 慧 周建新 邱伟芬

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，南京 210023)

我国是粮食消费大国，稻谷在我国饮食结构中占据重要的地位，为保证粮食安全，国家在粮食战略上制定了储备粮政策[1,2]。2016年，我国稻谷总产量超2亿t，其中稻谷存储量超1亿t。因自身生理生化变化及与外界环境间的相互作用，稻谷储藏中可能遇到各种安全问题[3,4]。

稻谷在储藏过程中最常见的微生物污染类群有放线菌、酵母菌、细菌和霉菌等[5]，其中对稻谷品质危害最大且最容易滋生的是霉菌。所以研究霉菌总数的变化情况对降低储粮损耗具有重要意义，而且有效控制稻谷储藏过程中由于霉菌污染而造成的产量损失，及控制高大平房仓稻谷的霉菌数量显得尤为重要。

传统的真菌鉴定方法主要是观察真菌在培养基上的颜色、形状、生长状态、生长速率及其在显微镜下的形态，进而确定真菌的种属地位。但是对于在培养基上培养的不产孢子的真菌，就无法利用形态学进行观察[6]。随着分子生物学技术的快速发展，在真菌鉴定分类中，核酸序列分析的方法已被广泛应用。目前常用的分子生物学方法有18SrDNA、ITS(internal transcribed spacer,ITS)序列分析技术。国内对储粮微生物活动规律和优势霉菌鉴定的研究已有报道。田国军等[7]研究了不同储藏条件下稻谷霉菌总数变化规律研究，研究表明由于上层稻谷受环境影响较大，其霉菌总数波动大于中、下层稻谷霉菌总数的波动，中、下层稻谷经过冬季通风降水降温后，粮温一直处于较低水平，因此霉菌总数较为稳定。和肖营等[8]研究了从实验稻谷中通过分离培养了一株可培养真菌优势菌，经18SrDNA和ITS序列鉴定其为扩展青霉。都立辉等[9]在4个地区的淮稻5号稻谷中分离出真菌33株，主要包括青霉、曲霉和镰刀菌等菌属，其中青霉属与曲霉属为优势菌，分别为16株和15株。国外研究学者也证实污染稻谷的真菌主要是曲霉、青霉、镰刀菌[10-14]。Ok等[15]对韩国6个区域80份新收稻谷样品的霉菌调查中，发现镰刀菌属是优势菌，其次是青霉属、疱霉属、漆斑菌属、分子孢子菌属。本研究分析了湖南与湖北省高大平房仓稻谷上中下三层的霉菌量差异及各层优势霉菌的分离与鉴定。利用传统的平板分离法将稻谷中可培养优势菌进行分离培养，并利用形态学及分子生物学两种手段相结合的方法对其中的优势菌进行种属的鉴定。湖南省、湖北省为我国稻谷的主产区，2省的稻谷年产量在全国排名分别位列第1、第5，两地气候均潮湿多雨，仓储稻谷易发霉。而且不同地区种植的稻谷品种不同，气候及储藏条件也不一致，会导致粮堆不同位置的稻谷品质与微生物污染情况各有差别。国内外对于稻谷粮堆不同位置稻谷品质及微生物污染情况的差异研究报道很少。因此， 研究高大平房仓内粮堆不同位置稻谷霉菌数量及微生物污染情况的差异，对我国的稻谷储藏有重要意义。在本研究中，利用了传统培养的方法分离培养了湖南与湖北两省粮仓内不同粮层的优势霉菌，并对两省粮仓不同层的霉菌量进行了比较，并利用形态学及分子生物学的方法对优势霉菌进行鉴定，对粮仓霉菌量防控及霉菌种类鉴定具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从湖南与湖北两省2015年与2016年粮库中采集稻谷样品，稻谷样品依照三层五点法(粮仓上、中、下三层，每层四个角落和中间设为采样点)，稻谷样品在温度(20±5) ℃ 和相对湿度(50±5)%的粮仓常规储藏条件下进行储藏。取样后，每种样品每层每点称量5 g，将每层5个点的稻谷样品混匀，制得25 g的混合稻谷样品，分别标记为HNS1(上层、中层、下层)、HNS0(上层、中层、下层)、HBS1(上层、中层、下层)、HBS0(上层、中层、下层)，在均质袋中4 ℃保藏。

1.2 试验试剂与仪器

SF-CF-2A超净工作台；VOSHIN-600R无菌均质机；ES-08B电子天平；BIOLOG ECO平板；LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌器；101-3AS型电热鼓风干燥箱；GNP-9160型隔水式恒温培养箱；ZEISS AXIO Scope A1显微镜；50%乙醇；乳酸石炭酸棉蓝染液。

1.3 试验方法

1.3.1 稻谷中优势霉菌的分离培养与保存

对本试验稻谷按照国标GB 4789.15—2010进行传统培养后，拍照记录霉菌菌落生长情况，并从中分离出单菌落，将该菌点接种到高盐察氏琼脂培养基上。并于28 ℃恒温培养箱中培养，培养6 d后将该菌株保存于10%的甘油中，备用。

1.3.2 粮库粮层霉菌菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(CFU)表示。若有两个连续稀释度的平板菌落数在10～150 CFU范围内，按式(1)计算：

(1)

式中：N为样品中菌落数；∑C为平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n1为第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n2为第二稀释(高稀释倍数)平板个数；d为稀释因子(第一稀释度)。

1.3.3 形态学观察1.3.3.1 霉菌培养特性的观察

将保存的霉菌接种于察氏琼脂培养基上，第六天观察其优势霉菌形态并拍摄菌落照片，根据霉菌的生长速度，培养时间，以及其菌落颜色，气味，形态，质地对其进行初步的判断。

1.3.3.2 霉菌显微特征鉴定

挑取菌落边缘的气生菌丝，制片。将其置入显微镜观察。观察其是有性或是无性繁殖，营养菌丝的情况，其在显微镜下的形态、颜色和大小。着重观察其菌丝形态及其分生孢子头的形态，并拍摄菌丝及孢子照片。根据霉菌的显微特征对其进行初步鉴定。

1.3.3.3 霉菌的显微特性分析

使用显微镜在400倍镜下选择合适的霉菌，换用1 000倍高倍镜进行观察。需找到所需的霉菌显微特征后，进行调焦使其在视野里清晰可见。将显微镜调节到拍照模式，在电脑上对视野里的霉菌进行观察，并适当调整焦距和色彩对比度，使所选的霉菌显微特征能在电脑屏幕清晰可见，控制电脑对图像进行捕捉。可用摄像机对不同对比度及焦距的霉菌进行拍摄，根据所需内容与拍摄结果，选取最为合适的照片。

1.3.4 分子生物学方法1.3.4.1 基因组DNA的提取

取25 μL保存于甘油的菌液,加入25 μL的真菌裂解液,85 ℃裂解15 min。提取的基因组DNA在1.5%的琼脂糖凝胶电泳中检测(105 V,45 min),然后用溴化乙锭(EB)染色,4 ℃保存备用,或者于-20 ℃中长期保存。

1.3.4.2 ITS基因片段的PCR扩增

ITS区域的扩增选择真核生物ITS通用扩增引物，正向引物为ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG反向引物为ITS4：TCCTCCGCTTATTGATAT；PCR的扩增条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

PCR扩增采用的50 μL反应体系，包括19 μL的ddH2O，25 μL的Mix，2 μL上游引物，2 μL下游引物，2 μL模板，PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭(EB)染色后，于4 ℃保存备用。

1.3.4.3 PCR扩增所得序列的测定

用琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行纯度的检测，确认电泳显色条带单一，可以进行扩增。运用PCR技术对其进行扩增，扩增的产物使用胶回收方法进行纯化。

1.3.4.4 DNA序列测序

将ITS的单克隆PCR产物交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。获得序列后，在GenBank数据库中进行BLAST比对,进而确定菌株的种属类别。

1.4 数据处理

使用Origin 8.5对试验数据作图。

2 结果与分析

2.1 粮仓中各层霉菌菌落数比较结果

由图1及图2可知，各层霉菌量均在104～105CFU/g数量级，稻谷处于安全储藏状态。从层数上看，湖南省储藏一年的霉菌数上层为1.1×103CFU/g，中层为6.4×103CFU/g，下层为1.4×103CFU/g，每层间距4 m(上层选在离粮库表面0.5 m的位置、下层选在离粮库地面0.5 m的位置，中层取粮库一半的位置)；即湖南省储藏一年的霉菌数上层<下层<中层，中层霉菌数最多，湖南省新入库的霉菌数上层为8.6×102CFU/g，中层为1.3×103CFU/g，下层为1.2×103CFU/g，即湖南省新入库的霉菌数上层<下层<中层，中层霉菌数最多；湖北省储藏一年的霉菌数上层为1.2×104CFU/g，中层为1.3×104CFU/g，下层为1.4×104CFU/g，即湖北省储藏一年的霉菌数上层<中层<下层，下层霉菌数最多；湖北省新入库的霉菌数上层为1.4×104CFU/g，中层为9.6×102CFU/g，下层为8.0×103CFU/g，即湖北省新入库的霉菌数中层<下层<上层，上层霉菌数最多。

图1 传统培养菌落形态

图2 粮堆不同深度稻谷的霉菌量比较

2.2 粮层中各层优势菌株的形态学鉴定

从湖南与湖北两省不同储藏时间的粮库中共分离出17种霉菌，如图3。粮仓上层的优势霉菌为图3(4)、图3(13)、图3(16)；粮仓中层的优势霉菌为图3(4)、图3(8)、图3(16)；粮仓下层的优势霉菌为图3(4)、图3(8)、图3(12)、图3(16)。经过霉菌培养基特性及1 000倍的光学显微镜观察，从图3(4)中可以看出，菌落在察氏琼脂上培养6 d后菌落直径达到了5～6 cm，菌落正面呈现黄绿色，菌落表面呈絮状；在1 000倍光学显微镜下，分生孢子头的顶囊呈近球形，分生孢子头紧密，孢子梗较光滑，小梗双层，小梗顶端的孢子呈球形。从图3(8)中可以看出，菌落在察氏琼脂上培养6 d后菌落直径为1～2 cm，6 d后菌落表面有部分区域呈现浅黄色，背面从白色逐渐变成淡黄色，菌落表面呈绒状；在1 000倍光学显微镜下，大部分分生孢子头的顶囊呈近球形，小梗生长较为疏松，孢子近球形。从图3(12)中可以看出，菌落在察氏琼脂上培养6 d后菌落直径为2 cm，菌落表面呈灰蓝色至暗蓝色，初期稍淡，老后渐深，近于暗蓝灰绿色，背面为白色，6 d后背面从白色逐渐变成淡黄色，菌落质地为丝绒状至絮状，致密。在1 000倍光学显微镜下，分生孢子头的顶囊呈近球形，分生孢子头疏散，孢子梗较光滑，小梗单层或双层，小梗顶端的孢子呈球形。从图3(13)中可以看出，菌落在察氏琼脂上培养6 d后菌落直径为2～3 cm，菌落初期为浅黄色，背面为浅黑色，培养6 d后，菌落表面呈现黄黑色，背面从浅黑色逐渐变成黑色。在1 000倍光学显微镜下，分生孢子头的顶囊呈半球形，分生孢子头上的小梗较为疏松，且双层，小梗顶端的孢子呈近球形。从图3(16)中可以看出，菌落在察氏琼脂上培养6 d后菌落直径为3～5 cm，菌落表面初为白色，后变为鲜黄色直至黑色厚绒状，背面中央略带黄褐色；在1 000倍光学显微镜下，分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子头的顶囊呈球形，双层小梗，分生孢子褐色球形。

注：1～17为霉菌菌落表面；1′～17′为霉菌菌落背面；1″～17″为1 000倍光学显微镜下霉菌的特征形态。图3 优势霉菌的特征

2.3 分子生物学分析

经测序，将其扩增出来的基因序列在GenBank进行BLAST，发现图3(4)与Aspergillus flavus的各种菌株相似度最高，与Aspergillus flavus ver-1、Aspergillus flavus isolate AF70、Aspergillus flavus isolate BN008等黄曲霉菌株的匹配一致性均为99%及以上。证明筛选出来的优势菌株是黄曲霉。图3(8)与Aspergillus candidus的各种菌株相似度最高，与Aspergillus candidus strain CHNSCLM-0393、Aspergillus candidus isolate TN-1、Aspergillus candidus strain RA16-10等白曲霉菌株的匹配一致性均为99%及以上。证明筛选出来的优势菌株是白曲霉。图3(12)与Aspergillus flavus的各种菌株相似度最高，与Aspergillus sp. isolate C7、Aspergillus sydowii strain CBS 128131、Aspergillus sydowii strain CBS 122.27等聚多曲霉菌株的匹配一致性均为99%及以上。证明筛选出来的优势菌株是聚多曲霉。图3(13)与Fungal endophyte voucher的各种菌株相似度最高，与Fungal endophyte voucher ARIZ:DM0184、Fungal endophyte voucher ARIZ:DM0130等内生真菌菌株的匹配一致性均为100%。证明筛选出来的优势菌株是内生真菌菌株。图3(16)与Aspergillus niger的各种菌株相似度最高，与Aspergillus niger strain BLIG、Aspergillus niger isolate J1、Aspergillus niger ATCC 16888等黑曲霉菌株的匹配一致性为100%。证明筛选出来的优势菌株是黑曲霉。

综合菌落、菌丝、孢子形态及ITS基因序列结果可知，粮仓上层的优势霉菌为黄曲霉菌株、内生真菌菌株、黑曲霉菌株；中层的优势霉菌为黄曲霉菌株、白曲霉菌株、黑曲霉菌株；下层的优势霉菌为黄曲霉菌株、白曲霉菌株、聚多曲霉菌株、黑曲霉菌株。

3 讨论

本研究的霉菌量在104～105CFU/g，而周建新等[16]研究了稻谷储藏稳定性与霉菌量有关，霉菌量在104CFU/g以下，稻谷处于正常的储藏状态,达到105CFU/g时开始发生霉变，106CFU/g以上时霉变已经相当严重。说明粮库中稻谷处于正常的储藏状态。本研究的高大平房仓粮库中，湖南省粮仓稻谷中层霉菌数最多，湖北省储藏一年的稻谷下层霉菌数最多，湖北省新入库的稻谷上层霉菌数最多。王荣雪等[17]研究了稻谷粮堆不同位置的霉菌数量级，中层的霉菌数量最多，其次是上层，下层最少。主要优势霉菌为曲霉属的灰绿曲霉、黄曲霉和白曲霉。说明粮仓不同位置的霉菌数和菌相会发生变化。

谢茂慧等[18]研究两次调查同一地区的大米进行比较显示，霉菌的菌相有很大的差异。所以本文研究的高大平房仓粮层霉菌数量与优势霉菌差异会随着客观条件的变化而变化着，而不是永远不变的。和肖营等[19]在粳稻4 t实仓储藏1年后优势菌种的分离与鉴定中发现亮白曲霉和溜曲霉为其中的优势菌。本研究也发现白曲霉菌株，说明两种菌株均为稻谷中常见菌。

鉴于黄曲霉、白曲霉、聚多曲霉、内生真菌、黑曲霉具有产生真菌毒素的可能性，其在稻谷中的生长及其真菌毒素的产生情况需要引起人们的进一步重视。本研究对高大平房仓不同粮层霉菌的霉菌数量及霉菌的分离鉴定为粮仓不同位置的污染情况及优势霉菌的检测提供了基础，对其真菌毒素的产生情况仍需进一步研究。

4 结论

本研究的高大平房仓粮库中，湖南省储藏一年的粮仓稻谷霉菌数上层为1.1×103CFU/g，中层为6.4×103CFU/g，下层为1.4×103CFU/g；即湖南省储藏一年的霉菌数上层<下层<中层。湖南省新入库的粮仓稻谷霉菌数上层为8.6×102CFU/g，中层为1.3×103CFU/g，下层为1.2×103CFU/g，即湖南省新入库的霉菌数上层<下层<中层，说明湖南省储藏一年稻谷与新入库稻谷中层霉菌数最多；湖北省储藏一年的粮仓稻谷霉菌数上层为1.2×104CFU/g，中层为1.3×104CFU/g，下层为1.4×104CFU/g，即湖北省储藏一年的霉菌数上层<中层<下层，说明湖北省储藏一年的粮仓稻谷下层霉菌数最多；湖北省新入库的粮仓稻谷霉菌数上层为1.4×104CFU/g，中层为9.6×102CFU/g，下层为8.0×103CFU/g，即湖北省新入库的霉菌数中层<下层<上层，上层霉菌数最多。

粮仓上层的优势霉菌为黄曲霉菌株、内生真菌菌株、黑曲霉菌株；中层的优势霉菌为黄曲霉菌株、白曲霉菌株、黑曲霉菌株；下层的优势霉菌为黄曲霉菌株、白曲霉菌株、聚多曲霉菌株、黑曲霉菌株。