枯草芽孢杆菌发酵制备玉米肽-葡萄糖螯合物的条件优化

刘 奇 张 智

(东北林业大学林学院，哈尔滨 150040)

目前我国玉米主要用于工业发酵制备酒精、生产玉米糖浆和淀粉。玉米在深加工生产玉米淀粉时会产生大量的副产物——玉米蛋白，该副产物硬度高、水溶性差，因此常被做为饲料廉价销售或丢弃，浪费资源的同时造成环境的污染[1]。

玉米肽是一种由玉米蛋白经水解后，通过肽键将氨基酸以不同的排列方式连接而成的具有特定空间结构的生物功能活性的短肽聚合物[2-3]。研究表明玉米肽具有抑制血管紧张素转换酶[4]、降低血压[5]、促进乙醇代谢、醒酒护肝[6]以及抗氧化[7-12]、缓解疲劳[13]、抗癌[14]等功能。越来越多的植物蛋白肽被广泛应用于幼儿辅食、功能保健食品中[15-21]。

常用的制备玉米活性肽的方法有酶解法、微生物发酵法和化学合成法[22]。微生物发酵法制备玉米肽可降低肽的苦味和抗营养因子，简化生产工艺的同时降低生产成本[23]等特点。螯合是一种高新技术，玉米肽-葡萄糖螯合物是通过微生物发酵产生的胞外酶将葡萄糖镶嵌在两个肽分子之间的一种稳定的连接形式，在提高肽稳定性的同时，提高其功能活性和适口性。张智[24]等利用玉米肽与锌、香菇多糖键合制备玉米肽与锌、香菇多糖的螯合物，发现该螯合物能显著(P<0.05)提高小鼠的非特异性免疫等功能，但由于锌、香菇多糖的成本相对较高，若能利用微生物发酵法将玉米肽与成本相对较低的葡萄糖螯合，制成功能活性肽应用于新资源食品领域的开发中，既可改善产品的适口性、提高玉米肽的化学稳定性及生物学效价，又可在节约资源的同时提高玉米副产物的附加值，实现粮食作物长久可持续发展。

本研究以玉米肽和葡萄糖为底物，通过单因素及响应面优化实验得出微生物发酵(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ls-45)制备玉米肽-葡萄糖螯合物的最优条件，为后续研究玉米肽-葡萄糖螯合物体内、体外抗氧化活性提供数据支持，为产业化生产玉米肽系列功能产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

种子培养基:葡萄糖0.5%、酵母膏1%、蛋白胨0.5%、氯化钠0.2%。

玉米肽；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ls-45；蛋白胨；酵母膏；葡萄糖；DPPH。

1.2 仪器与设备

722S可见分光光度计；TU-1810紫外分光光度计；5030-PVL程控压力蒸汽灭菌器；SW―CJ―IFD超净台；AR2140型分析天平；S220型pH计；ZD-85双功能气浴恒温振荡器。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米肽-葡萄糖螯合物制备方法

将玉米肽(通过Sephadex G-25分级得到肽段(平均分子质量为572 u，肽含量为75.83%))配制成底物浓度为4%的溶液，调节pH值至7；取50 mL玉米肽溶液，按投料比为8∶1的比例加入葡萄糖供体，再次调节pH值至7；121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却至室温；在无菌条件下接入枯草芽孢杆菌菌液进行发酵；得到的发酵液再次灭菌，冷却后4 500 r/min离心10 min；流水透析24 h，过滤后冷冻干燥得到最终玉米肽-葡萄糖螯合物。组分中玉米肽及葡萄糖的含量相对较高，所占比例为80.05%；玉米肽-葡萄糖螯合率为69.58%。

1.3.2 DPPH清除率的计算

将玉米肽-葡萄糖螯合物配制成3 mg/mL的样液备用，用95%的乙醇溶解DPPH粉末，配成0.2 mmoL/L的DPPH溶液。取待测样品溶液和DPPH各2 mL混匀，室温下避光放置30 min后，于517 nm处测吸光度值，记为OD1；对照组用95%的乙醇代替DPPH溶液，同样条件下室温下避光放置30 min后，于517 nm处测吸光度值，记为OD2；空白组用蒸馏水代替样液，于517 nm处测定吸光值，记为OD0。

(1)

式中：OD1为样液加DPPH溶液的吸光度值；OD2为样液加乙醇溶液的吸光度值；OD0为乙醇加DPPH溶液的吸光度值。

1.3.3 单因素试验优化玉米肽-葡萄糖螯合条件

以接种量、发酵时间、发酵温度、pH 4个因素研究不同发酵条件对玉米肽-葡萄糖螯合DPPH清除率的影响，并分别进行单因素试验。

1.3.3.1 接种量对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响

接种量分别为4%、6%、8%、10%、12%和14%，发酵时间48 h，发酵温度30 ℃，发酵液pH值6，摇床转速120 r/min，其余过程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制备方法，考察接种量对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响。

1.3.3.2 发酵时间对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响

选取发酵时间分别为24、36、48、60、72、84 h，发酵温度30 ℃，发酵液pH值6，摇床转速120 r/min，枯草芽孢杆菌接种量12%，其余过程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制备方法，考察时间对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响。

1.3.3.3 发酵温度对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响

选取发酵温度分别为25、30、35、40、45、50 ℃，枯草芽孢杆菌接种量12%，发酵时间48 h，发酵液pH值6，摇床转速120 r/min，其余过程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制备方法，考察温度对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响。

1.3.2.4 pH对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响

选取pH值分别为5、5.5、6、6.5、7和7.5，枯草芽孢杆菌接种量12%，发酵温度30 ℃，发酵时间48 h，摇床转速120 r/min，其余过程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制备方法，考察pH对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素试验结果，通过Design Expert 8.0.6软件，Box-Behnken实验设计原理，针对接种量、发酵时间、发酵温度和pH进一步设计四因素三水平的响应面优化试验，以DPPH清除率为指标，从而得出发酵最优条件。

表1 响应面分析试验因素与水平

1.3.5 数据分析

采用SPSS软件对数据统计分析，用Excel软件进行绘图处理。

2 结果分析与讨论

2.1 单因素条件确定

由图1接种量对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响可知，接种量从4%增加至10%时，DPPH清除率也随之从4.60%增加到38.00%，这可能由于接种量增加，枯草芽孢杆菌的发酵作用使玉米肽能更充分地与葡萄糖结合，形成具有功能活性的玉米肽-葡萄糖螯合物。当接种量从10%增加至14%，清除率又开始下降，这可能是由于底物浓度一定，随着接种量的增加，底物逐渐被消耗的同时也使得所合成的玉米肽-葡萄糖螯合物被消耗，故其DPPH清除率呈下降趋势。

图1 接种量、发酵时间、发酵温度、pH值对DPPH清除率的影响

由pH对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响可知，在pH 5到pH 6之间，玉米肽-葡萄糖螯合物玉米肽-葡萄糖螯合物的DPPH清除率逐渐升高，在pH为6时DPPH清除率达到最大83.08%。而从pH 6到pH 7.5，DPPH清除率开始呈减小趋势。在pH<6时供体DPPH清除率随pH增大而逐渐升高，说明在偏酸性环境下，玉米肽-葡萄糖螯合物抗氧化能力较好。

由发酵时间对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响可以看出随发酵时间的延长，玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率呈先升高后降低的趋势。发酵48 h时玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率从35.38%升高到80.47%。发酵48 h到84 h，随发酵时间延长玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率反而降低。这是由于在葡萄糖和玉米肽底物一定的情况下，随发酵时间延长，枯草芽孢杆菌将底物消耗的同时，也消耗了部分玉米肽-葡萄糖螯合物导致其DPPH清除率降低，因此后续实验选择发酵48 h为一个周期。

由发酵温度对玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影响可知，发酵温度在25～35 ℃时玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率随发酵温度升高而升高，35～50 ℃时随发酵温度升高，供体DPPH清除率降低，当温度为35 ℃时DPPH清除率最高。由此可知35 ℃为枯草芽孢杆菌发酵的最适温度。温度从35 ℃变化至50 ℃，玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率随温度升高而降低，其原因可能为温度过高破坏了酶活，同时使玉米肽的结构发生一定程度的变化，功能肽段部分被破坏甚至水解，无法发挥其作用。

2.2 响应面试验设计结果与分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

采用四因素三水平的响应面优化试验考察接种量、发酵时间、发酵温度和pH对玉米肽-葡萄糖螯合物的影响，结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果

如表2所示，采用Box-Be hnken模型，进行四因素三水平响应面分析试验，试验设计29个试验点，其中4个因子分别为A接种量(%)、B发酵时间(h)、C pH、D发酵温度( ℃)，以玉米肽-葡萄糖螯合物的DPPH清除率作为响应值。

微生物法修饰玉米肽的回归方程为：

y=+90.35+1.04A-0.54B+0.36C+1.86D+0.34AB-0.33AC-0.47AD+0.24BC-0.80BD+0.41CD-2.86A2-3.76B2-4.51C2-2.54D2

公式中y为响应值，A、B、C、D分别为对应的响应值。由公式可以看出拟合出的回归方程的二次项系数均为负数，因此实验中建立的模型的抛物面开口是向下的，即响应值存在最大值。

2.2.2 回归方程的方差分析

应用软件Design-Expert 8.0.6，根据中心响应面实验原理对表3中DPPH清除率数据处理，方差分析结果如表3。

表3 回归模型方差分析表

注:P<0.01，极显著，**；P<0.05，显著，*。

由表3可以看出P<0.000 1表明该模型极显著，R2为97.12%，调整R2为96.96%，说明拟合的方程较好。通过F值看出，试验中各因素对DPPH清除率的影响大小顺序为：D>A>B>C，即发酵温度>接种量>发酵时间>pH。所有二次项差异显著，其他项不显著。利用响应面法优化枯草芽孢杆菌发酵玉米肽-葡萄糖螯合物条件为：接种量10.28%，发酵时间46.80 h，pH 6.05，发酵温度36.85 ℃，此时DPPH清除率理论值为90.34%。

2.2.3 验证实验

从实际操作的角度考虑，验证实验选取的发酵条件为接种量10%，发酵时间46 h，pH 6，发酵温度37 ℃，该条件下实测值为90.82%，与理论值相差0.48%，故此条件为发酵的最佳工艺条件。

3 结论

通过单因素及响应面优化实验得出枯草芽孢杆菌优化玉米肽-葡萄糖螯合物的最优发酵条件为接种量10%，发酵时间46 h，pH 6，发酵温度37 ℃，此时DPPH清除率为90.82%。此研究弥补了利用微生物发酵法制备玉米肽-葡萄糖螯合物的空缺，提高玉米加工副产物附加值的同时，为后续研究该玉米肽-葡萄糖螯合物体内、体外抗氧化及细胞实验提供数据支持。