不同电解质溶液对反胶束萃取花生蛋白的影响

孙秀平 陈 军 陈锋亮 王宪昌 李明华 赵晓燕

(山东省农业科学院农产品研究所，济南 250100)

不同电解质溶液对反胶束萃取花生蛋白的影响

孙秀平 陈 军 陈锋亮 王宪昌 李明华 赵晓燕

(山东省农业科学院农产品研究所，济南 250100)

研究了 KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO48 种不同的电解质对 AOT/正己烷反胶束溶液萃取低温花生粕中花生蛋白的影响，对反胶束的含水量、蛋白质的提取率及通过SDS－PAGE电泳试验对蛋白质的亚基条带进行了比较。试验结果表明，电解质的种类会影响反胶束的含水量;阴离子与阳离子对反胶束溶液萃取大豆蛋白的前萃与后萃都有影响，电解质KCl和NaCl溶液所提取的蛋白质得率较高，分别为54.22%和50.19%;不同的电解质可以影响所得蛋白的亚基组成，可以用来分离不同的蛋白。

反胶束 电解质 花生蛋白 SDS－PAGE电泳

反胶束萃起源于20世纪70年代，本质上是一种液－液萃取，利用表面活性剂在有机相中形成反胶团，从而在有机相中形成分散的微水环境，使难溶于有机相或在有机相中发生生物活性变性的生物物质溶于其中的萃取技术，发展到现在已经有30多年的时间［1－2］，国内外众多学者对其已经进行了广泛研究。利用反胶束萃取蛋白质是瑞士科学家Luisi等［3］首次提出的。目前国内也有众多研究者对反胶束萃取植物蛋白进行了研究。磨礼现［4］以低温脱溶豆粕为原料对反胶束萃取过程进行了研究;陈复生等［5］、杨宏顺等［6］利用反胶束技术同时萃取植物蛋白和植物油。

反胶束体系，是表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中，当其浓度超过临界浓度(CMC)时，在有机溶剂中形成的纳米级聚集体［1，7］。反胶束萃取包括前萃(Forward Extraction)和后萃(Backward Extraction)两个过程。当反胶束溶液与蛋白质水溶液或含蛋白质的固相接触后，蛋白质可溶于反胶束的“水池”中，称为前萃;将含有蛋白质的反胶束溶液与另一水相接触，通过改变条件使蛋白质从反胶束转移到水相中从而分离出蛋白质，称为后萃［8］。反胶束配制过程中，加入不同的电解质会对反胶束的水池的大小等有影响，从而蛋白提取率及提取出来的蛋白质都会有所差异。

本试验主要研究了反胶束溶液中加入不同的电解质提取花生蛋白，对蛋白质提取率及通过SDSPAGE电泳试验对蛋白质的亚基条带进行了比较，以期为反胶束萃取蛋白提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 原料和试剂

低温花生粕:山东省高唐蓝山集团。

AOT(丁二酸二异辛酯磺酸钠)、正己烷、KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4:天津市富宇精细化工有限公司;卡尔费休试剂:天津赛孚瑞科技有限公司;试剂均为分析纯。

1.2 仪器和设备

AFK－1B水分自动测定仪:上海禾工科学仪器有限公司;K9860凯式定氮仪:美国海能;PHSJ－3F pH计:上海精密科学仪器有限公司;JY－SCZ2+垂直电泳槽、JY300C电泳仪:北京君益东方电泳设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料花生粕成分分析

水分测定:GB 5009.3—2010;粗脂肪含量的测定:GB 5009.6—2003;粗蛋白的测定:GB 5009.5—2010;灰分的测定:GB 5009.4—2010;总糖的测定:3，5—二硝基水杨酸法;氮溶解指数(NSI)的测定:AACC方法46－23。

1.3.2 花生蛋白的提取工艺

AOT反胶束溶液配制:取适量的AOT加入到适量的正己烷中，超声振荡使其溶解使其浓度为0.08 g/mL，待溶液透明后中分别加入适量的浓度为0.05 mol/L KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4的 KH2PO4+Na2HPO4缓冲液(调节 pH 7.0)。图1是反胶束萃取花生蛋白的工艺流程图。

图1 反胶束萃取分离花生蛋白的工艺流程图

1.3.3 反胶束溶液中含水量的测定［9］

采用卡尔费休法测定反胶束溶液含水量。首先用卡尔费休试剂将甲醇中的水分滴去，然后向甲醇溶液中加入10 μL水，再用卡尔费休试剂滴定至终点，测定卡尔费休试剂的响应系数。

响应系数A=进样水分的质量/消耗的卡尔费休试剂体积

准确量取50 μL的反胶束溶液，加入到甲醇溶液中，再用卡尔费休试剂滴定至终点，则反胶束溶液中所含水分质量为:

反胶束所含水分的质量=A×消耗的卡尔费休试剂体积

反胶束溶液含水量W0=反胶束溶液增溶水分的物质的量/反胶束溶液中表面活性剂的物质的量

1.3.4 蛋白萃取率的计算

分别取40 mL配制好的反胶束溶液，根据1.3.2的试验结果分别加入 0.05 mol/L 的 KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4缓冲溶液，使各种反胶束溶液含水量W0值达到最大。然后加入一定量的低温花生粕(精确到0.000 1 g)，在一定温度的水浴恒温振荡器中振荡一段时间，然后进行离心分离去除残渣。利用凯氏定氮法测定前萃液中的蛋白质含量，计算蛋白前萃率。

蛋白前萃率=反胶束溶液中蛋白质的量/样品中蛋白质的量×100%

向一定体积的前萃液中加入等体积的1 mol/L的 pH 7.0 的 KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4缓冲溶液，在一定温度的水浴恒温振荡器中振荡一段时间后离心，上层为含有油脂的有机相，下层为含有蛋白质的水相。利用凯氏定氮法测定后萃液中的蛋白含量，计算蛋白后萃率。

蛋白后萃率=水相中蛋白质的总量/前萃液中蛋白质的总量×100%

1.3.5 SDS － PAGE 电泳试验［10］

取适量不同电解质的后萃液，4℃下透析24～48 h，通过SDS－PAGE电泳试验鉴别花生蛋白亚基结构的变化。配制分离胶为15%，浓缩胶为4.5%;稳流法20 mA，染色20 min，脱色48 h以上。反胶束蛋白提取液上样量分别是15 μL，用考马斯亮蓝染色，然后用脱色液进行脱色。

2 结果与分析

2.1 原料主要成分分析

原料主要成分分析结果如表1所示。

表1 原料主要成分含量

2.2 电解质种类对反胶束含水量的影响

图2反映了不同电解质种类对AOT反胶束含水量的影响。从图2中可以看出，对不同种类的电解质缓冲溶液，反胶团的含水量均呈现先增大后减小的趋势。通常反胶束中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上，因此阳离子的种类会影响，该密度越大，产生的反胶束也越大［11］。因此对于不同的单价阳离子(Li+，Na+和K+)，由于其离子半径不同(Li+﹤Na+﹤K+)而导致反胶束内表面的电荷密度不同，从而导致反胶束的大小不同，表现结果即为含水量不同。在没有破环反胶束体系的前提下，加入相同体积的缓冲溶液，离子半径越小，反胶束的含水量越大。通过对分别加入 NaCl、NaNO3、Na2SO4缓冲溶液，KCl、KNO3缓冲溶液和MgCl2、MgSO4缓冲溶液的3组对比发现，阴离子种类对反胶束含水量的影响较小。

图2 电解质种类对反胶束含水量的影响

2.3 电解质溶液种类对AOT反胶束提取花生蛋白的影响研究

在AOT反胶束体系分别加入适量的KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4、MgSO4的 KH2PO4+Na2HPO4缓冲液(调节pH 7.0)，提取蛋白前萃率与后萃率的结果如图3。

图3 电解质种类对蛋白萃取率的影响

由图3可以看出，电解质的种类不同将会引起反胶束中蛋白质的分布不同。在前萃液中，一价阳离子盐类萃取率 KCl＞NaCl＞NaNO3＞KNO3＞Na2SO4＞LiCl和二价阳离子盐类萃取率MgSO4＞MgCl2。相比较而言，总的趋势是一价阳离子的盐类提取率高于二价阳离子盐类，这与Kinugasa等［12］研究其他的离子的试验结论不一致。这可能是因为，对于不同种类的蛋白质电解质种类对其的影响不同［13］。在后萃液中，同样呈现一价阳离子的盐类提取率高于二价阳离子盐类的规律，这与赵晓燕等［14］在不同电解质溶液对AOT反胶束溶液萃取大豆蛋白的影响研究中得出的结论一致。另外，阴离子的种类对蛋白后萃率也有一定的影响，NaCl＞NaNO3＞Na2SO4，可能是因为带负电荷的蛋白质分子与NO3－、Cl－、SO42－发生了离子交换作用［15］，使蛋白质进入反胶束。KCl和NaCl所提取的蛋白质得率较高，分别为54.22%和50.19%，如果将前萃和后萃的工艺进一步优化，蛋白萃取率有可能进一步提高。

2.4 SDS－PAGE电泳试验

图4是在反胶束体系中加入不同的电解质溶液所提取的花生蛋白的SDS－PAGE电泳图谱。由图4中可以看出，不同的电解质溶液对所提取的花生蛋白的亚基组成有一定影响，这与Shiomori等［16］发现的在AOT反胶束中添加不同的盐离子可提取不同种类的蛋白的结论一致。加入NaNO3和KNO3的反胶束溶液所提取的蛋白分子质量在18.4～45.0 ku附近的亚基较多，蛋白分子质量在45.0～66.2 ku附近没有亚基，而加入KCl和NaCl的反胶束溶液所提取的蛋白分子质量在18.4～66.2 ku范围内亚基都有所分布，这说明Cl－与NO3－相比更加有利于大分子蛋白的提取。与花生分离蛋白电泳图相比较，加入KCl和NaCl所提取的蛋白亚基相似，这说明AOT反胶束中添加KCl和NaCl相对比较有利于花生蛋白的提取。

图4 反胶束体系中加入不同电解质提取的花生蛋白的电泳谱图

3 结论

3.1 卡尔费休法测定反胶束溶液含水量的试验表明，加入不同的电解质会对反胶束的W0有影响，从而影响蛋白萃取率。

3.2 通过对反胶束中加入不同电解质提取花生蛋白的研究，得出各种不同的阴离子、阳离子由于离子半径、电荷种类、电荷量的不同对蛋白的萃取过程有一定的影响，从而使得蛋白的前萃率和后萃率均有所不同。通过试验可知，电解质KCl和NaCl溶液所提取的蛋白质得率较高，分别为54.22%和50.19%。

如果将前萃和后萃的工艺进一步优化，蛋白萃取率有可能进一步提高。

3.3 SDS－PAGE电泳试验表明，反胶束中加入不同的电解质可以影响所得蛋白的亚基组成，可以用来分离不同的蛋白。

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Effect of Different Salt Solutions for Extraction of Peanut Protein in Reverse Micelles

Sun Xiuping Chen Jun Chen Fengliang Wang Xianchang Li Minghua Zhao Xiaoyan
(Institute Agro － Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji'nan 250100)

The review studied on effect of different salt solutions(KCl，NaCl，LiCl，MgCl2，NaNO3，KNO3，Na2SO4，MgSO4)for extraction of peanut protein in AOT/N －hexane reverse micelles from the low －temperature peanut meal，and compared with the W0of the reverse micelles and protein ratio.By SDS － PAGE electrophoresis experiment，compared with subunits of protein.The results showed that different salt solutions could cause the changes of W0.The anions and cations could affect the extraction of soybean protein in AOT reverse micelle.In salt solutions，the KCl and NaCl solutions in reverse micelles would benefit for protein extraction，the assignment of protein was 54.22%and 50.19%，respectively.The different salt solutions could cause the subunits of protein，which can be used to separate different kinds of protein.

reverse micelle，salt solution，peanut protein，SDS － PAGE

TS201.4

A

1003－0174(2012)09－0076－04

山东省科技发展计划(2011GGC02044)，山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2010NY027)

2011－12－01

孙秀平，女，1985年出生，硕士，农产品加工及贮藏工程

赵晓燕，女，1975年出生，副研究员，硕士生导师，食品理论与加工应用及生物粉体技术