微波辅助回流提取葵花籽粕绿原酸的研究

何荣海 翟庆娇 仲晗实 刘 磊 蒋 边 廖 艳 马海乐

(江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室1，镇江 212013)

(西北农林科技大学食品学院2，杨凌 712100)

微波辅助回流提取葵花籽粕绿原酸的研究

何荣海1翟庆娇1仲晗实2刘 磊1蒋 边1廖 艳1马海乐1

(江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室1，镇江 212013)

(西北农林科技大学食品学院2，杨凌 712100)

以微波辅助回流提取的方法从葵花籽粕中提取绿原酸。研究了微波辅助提取绿原酸过程中料液比、微波辐射功率、乙醇体积分数以及提取时间对绿原酸得率影响的单因素试验，并在单因素试验基础上进行了正交试验，得出优化的微波辅助回流提取参数为:料液比1∶18、微波辐射功率390 W、乙醇体积分数35%和提取时间20 min，在此条件下绿原酸提取率达到94.6%、得率为2.11%。对提取的绿原酸产品进行抗氧化试验，结果表明葵花籽粕绿原酸对DPPH自由基有显著清除作用，其对DPPH自由基的EC50值为 2.6 mg/L。

葵花籽粕 绿原酸 微波辅助回流提取

葵花籽是一种重要油料作物，我国葵花籽资源丰富，年产量达125万吨［1］，葵花籽提取油脂后的葵花籽粕(Sunflower Seed Meal，SSM)营养价值较高，但一般用作饲料或肥料，对其深加工利用报道不多，曾有人研究从葵花籽粕制备分离蛋白［2］，研究者也曾从葵花籽粕蛋白制备得到降血压肽(血管紧张素转换酶抑制肽)［3］。葵花籽粕除富含蛋白质外，绿原酸质量分数也很丰富达1.1%～4.5%，绿原酸有较高的药用价值，还可作为抗氧化剂用于食品工业［4］。

植物中绿原酸的提取方法较多，如水提醇沉法［5］、醇提铅盐沉淀法［6］、超声波法［7］、超临界 CO2萃取法［8］、超滤法［9］以及酶法［10］等。不过这些方法都存在一些缺陷，如水提醇沉法醇沉过程中伴随吸附夹带，使部分绿原酸消失;醇提铅盐沉淀法工艺复杂、产量低，并使用有毒金属铅，可能对绿原酸产品造成一定的污染;超声波法限于设备规模，放大到工业生产还存在困难;超滤法对提取液预处理要求高，产量易受超滤条件的影响，而且膜清洗麻烦;超临界CO2萃取法和酶法的生产成本较高，目前不能应用于工业生产。

近年来，使用微波加热辅助提取植物成分的技术越来越受到人们的重视。与传统方法比较，微波辅助萃取具有提取效率高、溶剂使用少、可保护不耐热成分等优点，已经在食品资源有效成分萃取中有较多的应用，目前国内已经能生产工业化微波萃取设备［13－14］。本试验研究用自制的回流式微波辅助萃取(Refluxing Microwave－Assisted Extraction，RMAE)装置提取葵花籽粕中的绿原酸，确定最佳提取工艺条件并对提取的葵花籽粕绿原酸(Sunflower Seed Meal Chlorogenic Acid，SSMCA)进行抗氧化性能的初步测试。

1 材料与方法

1.1 试验材料

葵花籽粕:新疆金新海油脂有限公司;绿原酸标样(分析纯):中国药品生物制品鉴定所;无水乙醇(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH):Sigma－Aldrich中国有限公司。

1.2 仪器和设备

UV－1601紫外分光光度计:北京瑞利分析仪器公司;MG08S－2B微波实验仪:南京汇研微波系统工程有限公司，本试验中已经对其进行了改造，安装了冷却回流装置，并采用磁力搅拌装置可在烧瓶中搅拌防止爆沸(图1);HH－S2数显恒温水浴锅:金坛市医疗仪器厂;LD5－10B离心机:北京雷勃尔离心机有限公司。

图1 回流式微波辅助萃取装置示意图

1.3 试验方法

1.3.1 绿原酸的标准曲线制作

采用紫外可见分光光度计法测定绿原酸含量。选择325 nm作为检测波长，绘制标准曲线:准确称取绿原酸标品1.30 mg，置于25 mL容量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀配置成标准溶液。准确吸取绿原酸标准溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 和6.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度。以50%乙醇为空白对照在波长325 nm下测定不同浓度绿原酸的吸光度。以绿原酸标品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2 微波辅助提取的试验步骤

粉碎:将葵花籽粕用粉碎机粉碎至40目的粉末，供微波萃取使用。

原料中绿原酸含量测定:称取5 g粉碎的葵花籽粕，加入到盛有200 mL甲醇烧杯中，30℃密闭磁力搅拌提取一昼夜，过滤后将滤液离心，测定离心液体积和其中绿原酸含量，计算原料中绿原酸含量。

微波辅助提取:称取12 g的粉碎后的葵花籽粕样品，将其放入到萃取烧瓶中，然后加入500 mL一定体积分数的乙醇水溶液，将烧瓶接冷凝管后在微波条件下萃取，萃取结束后待其自然冷却。

离心:冷却后的料液用离心机离心，取上清液于烧杯中，封口。

分光光度法测定吸光值:将离心好的上清液在325 nm下测定吸光度，根据绿原酸标准曲线得出微波提取粗品中绿原酸的含量。按下式计算出绿原酸的得率。

1.3.3 微波辅助提取的单因素试验

分别选取微波辅助提取时间、微波功率、料液比和乙醇体积分数进行单因素试验。试验中除所考察因素外，其他提取参数分别为提取时间20 min、微波功率390 W、料液比1∶15和乙醇体积分数50%。提取液冷却后离心，测定上清液中绿原酸含量，计算绿原酸得率。每个试验重复3遍，结果取平均值。

1.3.4 微波辅助提取的优化试验

根据单因素试验的结果确定正交优化参数试验的因素和水平进行正交试验。每个试验结束等料液冷却后离心，测定上清液中绿原酸含量，计算绿原酸得率。每个试验重复3遍，结果取平均值。

1.3.5 葵花籽粕绿原酸清除DPPH自由基能力的测定方法［15］

将在优化提取的条件下得到的葵花籽粕绿原酸产品用双蒸水稀释成不同的浓度梯度，各取2 mL于试管中，再加入2 mL 0.04 mg/mL的DPPH溶液，混合均匀，反应20 min，3 500 r/min离心分离10 min，取上清液在517 nm处测其吸光值为Ai;另各取2 mL上述浓度的绿原酸产品于试管中，分别加入无水乙醇2 mL，反应20 min，3 500 r/min离心分离10 min，取上清液在517 nm处测其吸光值记为Aj;以2 mL 0.04 mg/mL DPPH和2 mL无水乙醇反应液做为参比，其吸光值记为A0。按照下式计算葵花籽粕绿原酸对DPPH自由基的清除率E(DPPH):

E(DPPH)=［1－(Ai－Aj)/A0］×100%

式中:A0为2 mL DPPH溶液+2 mL无水乙醇的吸光值;Ai为2 mL DPPH溶液+2 mL样品的吸光值;Aj为2 mL无水乙醇+2 mL样品的吸光值。

2 结果与分析

2.1 绿原酸标准曲线的制作及葵花籽粕中绿原酸含量的测定

按照1.3.1的方法绘制得到绿原酸标准曲线，如图2所示。

图2 绿原酸标准曲线

据标准曲线可以得到绿原酸浓度的回归方程式:c=(A+0.010 6)/0.069 7，式中:c为绿原酸质量浓度/mg/L;A为吸光度。

根据标准曲线，按1.3.2中的方法测定得到本试验原料葵花籽粕中绿原酸质量分数为2.23%。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 微波辅助提取时间对绿原酸得率的影响

葵花籽粕绿原酸得率随微波辅助提取时间的变化如图3所示。从图3可以看出，在提取开始的20 min时间内，绿原酸得率随提取时间延长显著增加，在20至30 min维持不变，提取时间达到60 min时得率略有降低。上述试验结果表明，提取20 min左右之后再延长时间对得率的提高没有帮助，而时间太长(如提取60 min)造成得率下降可能是由于绿原酸在微波作用或加热条件下发生部分降解。根据试验结果，将提取时间定为20 min，在提取参数优化试验中按此条件进行试验。

图3 微波辅助提取时间对葵花籽粕绿原酸得率的影响

2.2.2 微波功率对绿原酸得率的影响

图4 微波辅助提取功率对葵花籽粕绿原酸得率的影响

图4 结果表明，微波功率在190～520 W范围中，绿原酸得率随微波功率增加而提高，当微波功率大于520 W时绿原酸得率无显著改变。一般来说，微波保持较高的功率时，细胞壁在微波作用下破裂更快，细胞内物质更容易溶解到溶剂中，因而提取效率更高;但当细胞壁在高功率微波作用下破碎程度很高时，再增加微波功率对提取效率影响有限。根据本试验结果，可以选择390、455和520 W作为正交试验中功率因素的3个试验水平。

2.2.3 料液比对绿原酸得率的影响

葵花籽粕与乙醇溶液料液比对绿原酸提取得率的影响如图5所示。从图5可以看出，绿原酸得率随提取溶剂所占比例增大而提高，特别是料液比在1∶6至1∶12范围内时，溶剂比例增加对绿原酸得率的影响更显著。在使用溶剂提取的方法中，较高比例的溶剂体积对于固体基质的提取更有效，但考虑到实际生产中后续加工需要将溶剂蒸发掉，需要耗费大量能源，因此一般不能仅依据产品得率选择料液比。考虑以上情况，在后面的提取参数优化试验中对料液比因素选择1∶12、1∶15和1∶18为3个试验水平。

图5 料液比对葵花籽粕绿原酸得率的影响

2.2.4 乙醇体积分数对绿原酸得率的影响

如图6所示，不同的乙醇体积分数提取时绿原酸的得率不同，乙醇体积分数在40%以下时绿原酸得率随体积分数的增大明显升高，在40%以上随体积分数增加而减小。这是由于溶剂不同的介电性能及极性而造成的。40%体积分数的乙醇对葵花籽粕绿原酸的溶出性能在所试验的范围内是较好的。

图6 乙醇体积分数对葵花籽粕绿原酸得率的影响

2.3 提取条件的优化试验结果

根据单因素试验结果，选择微波功率、料液比、乙醇体积分数3个因素进行正交试验，提取时间为20 min。试验因素水平和试验结果分别如表1和表2所示。

表1 正交试验因素和水平

表2 正交试验结果

由表2看出，料液比对得率影响最大，其次是乙醇体积分数和微波功率。极差分析的结果表明，绿原酸的最佳提取工艺为:A1B3C2，即微波辐射功率为390 W，乙醇体积分数为35%，料液比为1∶18，在此条件下绿原酸得率为2.11%，前面研究中测定原料绿原酸质量分数为2.23%，因此微波辅助提取优化条件下葵花籽粕绿原酸提取率达到94.6%，考虑到提取时间仅为20 min，微波辅助提取效率绿原酸具有很高的效率。

2.4 葵花籽粕绿原酸清除DPPH自由基的能力测定

按照1.3.3的方法测定得到葵花籽粕绿原酸清除DPPH自由基的性能，结果如图7所示。由图可以看出，葵花籽粕绿原酸在1.0 mg/mL至7.0 mg/mL范围对DPPH自由基表现出较强的清除效果，且绿原酸浓度与DPPH清除率呈线性关系，葵花籽粕绿原酸对DPPH自由基的半数影响浓度(median effective concentration，EC50值)为 2.6 mg/L。据文献资料报道金银花中绿原酸对DPPH自由基清除率为74%时所需质量浓度为100 mg/L［16］，而根据图7回归方程式计算得，葵花籽粕绿原酸样品对自由基清除率74%时的质量浓度仅为5.8 mg/L，可见本试验从葵花籽粕提取的绿原酸产品有较高的抗氧化性能，具有广阔的应用前景。

图7 葵花籽粕绿原酸对DPPH自由基的清除作用

3 结论

本研究采用微波辅助回流的方式提取葵花籽粕中的绿原酸，通过对提取过程参数进行单因素试验和优化试验，确定最终提取条件为:料液比为1∶18、微波辐射功率390 W、乙醇体积分数为35%、提取时间20 min，在此条件下绿原酸得率为2.11%，提取率达到94.6%。本研究的微波辅助回流提取仅用20 min，大大缩短提取时间，对提高生产效率有明显的价值。经测定，葵花籽粕绿原酸对DPPH自由基有明显清除作用。

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Study on Refluxing Microwave－Assisted Extraction of Chlorogenic Acid from Sunflower Seed Meal

He Ronghai1Zhai Qingjiao1Zhong Hanshi2Liu Lei1
Jiang Bian1Liao Yan1Ma Haile1
(School of Food and Biological Engeering at JiangSu University Jiangsu Key Laboratory of Agricultural Product Physical Processing1，Zhenjiang 212013)
(School of Food Science and Engineering at Northwest A ＆ F University2，Yangling 712100)

Refluxing microwave－assisted extraction(RMAE)of chlorogenic acid from sunflower seed meal(SSM)was investigated in this study.Effects of SSM to solvent ratio，microwave power，ethanol concentration and extraction time on the yield of sunflower seed meal chlorogenic acid(SSMCA)were investigated by single factor tests，respectively.Based on result of single factor tests，orthogonal test of SSMCA extraction was explored in this study.And the optimal extraction parameters were decided by orthogonal test as follows:SSM to solvent ratio 1∶18，microwave power 390 W，ethanol concentration 35%and extraction time 20 min.At this extraction condition，the extraction rate and the yield of chlorogenic acid are 94.6%and 2.11%，respectively.SSMCA shows remarkable scavenging effect on 1，1 －Diphenyl－2 － picrylhydrazyl(DPPH)free radical，and its median effective concentration(EC50value)is 2.6 mg/L.

sunflower seed meal，chlorogenic acid，refluxing microwave － assisted extraction

TS201.1

A

1003－0174(2012)09－0107－05

高等学校博士学科点专项科研基金(2009322712 0012)，中国博士后基金(201004 71386)，江苏省博士后基金(0902029C)，江苏省科技支撑计划(BE2011 401)，江苏高校优势学科建设工程资助项目(一期省属高校016)

2011－12－28

何荣海，男，1971年出生，博士，副教授，食品物理加工技术