葡萄糖和蛋白胨对绿色木霉纤维素酶系分泌特性的影响

戴四发 贺淹才

(安徽科技学院动物科学学院1,凤阳 233100)

(华侨大学材料科学与工程学院2,泉州 362011)

葡萄糖和蛋白胨对绿色木霉纤维素酶系分泌特性的影响

戴四发1贺淹才2

(安徽科技学院动物科学学院1,凤阳 233100)

(华侨大学材料科学与工程学院2,泉州 362011)

采用正交试验法分析出绿色木霉 3.3711液体发酵产纤维素酶系各组分的最适酶解条件,其组合分别为 C1(pH 5.0、45℃),Cx(pH 3.5、55℃)和βG(pH 4.5、65℃)。在液体基础产酶培养基发酵条件下,三种组分酶的最高酶活分别为 53.6、185.2、79.3 u/mL,比酶活分别为 46.6、167.7、71.8 u/mg,最高的酶活形成时间分别为 9、10、10 d。添加质量分数 0.0005～0.003的葡萄糖,三种组分酶最高酶活分别降低了 27.4%～38.4%、25.5%～35.5%、14.0%～52.3%,C1和 Cx的最高酶活形成时间分别缩短为 4～7、5 d,C1和βG比酶活分别降低了 20.8%～35.4%、25.8%～64.5%;添加质量分数 0.0005～0.01的蛋白胨,提高了 C1和 Cx最高酶活 (分别为 0.9%～199.6%、2.1%～45.1%),缩短了 C1和 Cx的最高酶活形成时间 (分别为 4～7、4 d),降低了βG的最高酶活 (5.9%～34.2%)和比酶活 (35.2%～87.3%),对 C1和 Cx比酶活的增减效应存在浓度依赖性,质量分数 0.0005时分别提高 50.0%、65.4%。两种添加物均能明显改变 C1和 Cx的分泌变化规律,对βG酶影响极小。

绿色木霉 纤维素酶系 分泌特性 葡萄糖 蛋白胨

随着近些年广泛而深入的研究,纤维素酶在食品、农业、医药、纺织、化工等领域得到越来越广泛的应用。真菌纤维素酶是一类复杂的复合酶系 (Cellu2 lase system),一般被认为包括三种水解酶,即内切葡聚糖酶[endoglucanase;1,4(1,3,1,4)-β-D-glu2 can 4 glucanohydrolase;EC 3.2.1.4,简称 C1酶或EG]、外切葡聚糖酶 [exoglucanase;1,4-β-D-glu2 can cellobiohydrolase;EC3.2.1.91,简称 Cx酶 ,亦称外切纤维二糖水解酶 (CBH)]和β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase;β-D-glucoside glucohydrolase;EC3.2.1.21,简称βG酶,亦称纤维二糖酶)。C1酶与 Cx酶又存有多种异构酶。只有各组分酶协同作用才能将纤维素彻底水解为葡萄糖[1-2]。

绿色木霉是目前国内外常用的一种生产纤维素酶的工业用菌,关于其产酶研究已有许多报道,普遍认为,该纤维素酶具有较高的 Cx和 C1酶活,但βG酶活较低 (与曲霉属如黑曲霉纤维素酶相比),导致其彻底分解纤维素的能力受到限制[1,3-4]。前期的研究[1,5-8]中发现,三种组分酶在发酵形成过程中存在明显的时差性,Cx和 C1酶一般在 4～5 d即达到酶活的较高值或峰值,βG酶则在 8～9 d后才出现较高值。而目前关于绿色木霉纤维素酶活的分析报道一般都是在发酵的第 4～6 d时进行取样的,且大多是依据单一组分酶 (一般是 Cx酶)的活性进行考虑的[4,9],进而导致对该酶系活性分析的片面性。因此,为了改善绿色木霉纤维素酶系各组分的均衡性以期有效提高其品质和产量,有必要对该酶系各组分在发酵过程中的形成规律和一些营养素的影响效应进行深入研究。葡萄糖和蛋白胨能在微生物生长代谢过程中提供必需的碳源和氮源,是常用的培养基和发酵液成分,因此,本试验针对绿色木霉纤维素酶系的分泌特性,就不同组分酶的最高酶活,、比酶活及最高酶活形成时间以及添加不同质量分数的葡萄糖和蛋白胨对这些分泌特性的影响效应进行初步分析,为进一步深入探讨该酶系分泌规律和提供工业生产参考建立一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 菌种及来源

绿色木霉 (Trichoder m a viride)3.3711:中国科学院微生物研究所菌种组。

1.2 主要试剂与设备

纤维素粉、葡萄糖和蛋白胨:Sigma公司;754紫外可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;SPX-150B生化培养箱:上海跃进医疗器械厂;KYC-111摇床:杭州雷琪实验器材有限公司;HH-2数显恒温水浴锅:国华电器有限公司;BK5000生物显微镜:重庆奥特光学仪器有限责任公司。

1.3 培养基与菌种保藏

1.3.1 斜面培养基

土豆汁葡萄糖琼脂培养基。将孢子接种于斜面培养基,28℃培养,待形成一层绿色孢子后 (约 7 d)于 4℃保藏备用。1.3.2 基础培养基

加浓的Mandles盐[5]添加质量分数分别为 0.01和 0.02的纤维素粉和麦麸粉。1.3.3 产酶培养基

基础培养基添加不同浓度的葡萄糖和蛋白胨。

1.4 孢子悬液与酶液制备

1.4.1 孢子悬液制备

从新长成的斜面洗下孢子,以磁力搅拌器搅拌约 20 min,打散孢子后显微镜记数,并调节孢子浓度至 (1.00±0.05)×107个 /mL。

1.4.2 酶液制备

将孢子悬液以体积分数 0.1的接种量接入均装有 50 mL产酶培养基的 3只 250 mL摇瓶中,转速190 r/min,28℃发酵培养,每过 24 h取适量发酵液 3份,分别 4 000 r/min离心 15 min,以 0.1 mol/L磷酸氢二钠 -0.1 mol/L柠檬酸缓冲液适当稀释上清液即为酶液。

1.5 定糖分析

改进的 DNS法[6],以葡萄糖为标准,以相同稀释倍数的酶液作为空白对照。

1.6 蛋白质测定

Bradford法[5],以牛血清白蛋白为标准。

1.7 酶活测定和比酶活 (U0)计算

1.7.1 C1酶活测定

取 pH 5.0酶液 1.0 mL,加入装有 (25.0±0.5)mg固体脱脂棉的试管中密封,于 45℃酶解 20 h后定糖。酶活力单位U(u/mL)为每小时由底物产生还原糖 (以葡萄糖计)的微摩尔数。

1.7.2 Cx酶活测定

取酶液 0.25 mL,加入 0.25 mL pH 3.5的质量分数为 0.005的羧甲基纤维素钠溶液中,于 55℃酶解 30 min后定糖。酶活力单位 (U)同 C1。

1.7.3 βG酶活测定

酶解底物为质量分数为 0.005的水杨素溶液,酶解 pH为 4.5,温度为 65℃。酶解方法同 Cx酶活测定,酶活力单位同 C1。

1.7.4 比酶活 U0(u/mg)的计算

U0=U/w,式中:w为蛋白质质量分数 /mg/mL。

2 结果与分析

2.1 绿色木霉纤维素酶系各组分最适酶解条件分析

取以基础培养基为产酶培养基制得的酶液作为试验材料,通过两因素 (pH和温度 T)多水平正交试验法分析 C1、Cx和βG的最适酶解条件。酶活结果分别见表 1～3。结果表明,C1酶最适作用条件组合为 pH 5.0和 45℃(酶活为 27.6 u/mL),Cx酶最适作用条件组合为 pH 3.5和 55℃(酶活为168.0 u/mL),βG酶最适作用条件组合为 pH 4.5和65℃(酶活为 9.7 u/mL)。

表 1 绿色木霉 3.3711纤维素酶系 C1酶最适酶解条件分析单位:u/mL

表 2 绿色木霉 3.3711纤维素酶系 Cx酶最适酶解条件分析单位:u/mL

表 3 绿色木霉 3.3711纤维素酶系βG酶最适酶解条件分析单位:u/mL

2.2 葡萄糖对绿色木霉产纤维素酶特性及酶系分泌特性的影响

2.2.1 葡萄糖对酶系各组分最高酶活、比酶活及其形成时间的影响

表 4表明,发酵液中添加葡萄糖,各组分最高酶活都明显降低,分别降低了 27.4%～38.4%(C1)、25.5% ～35.3%(Cx)和 14.0% ～52.3%(βG),且降低程度均随其质量分数增高而增加;最高酶活形成时间除βG酶 (10 d)保持不变外,C1酶不同程度的由9 d缩短为 4～7 d,Cx酶均由 10 d缩短为 5 d;比酶活以 C1和 βG酶有明显降低,分别为降低了20.8%～35.4%和 25.8%～64.5%,Cx酶则在质量分数低于 0.000 75时有升高,高于 0.001时则降低。

表 4 葡萄糖对绿色木霉 3.3711产纤维素酶系各组分最高酶活、比酶活及其形成时间的影响

2.2.2 葡萄糖对酶系形成过程中各组分分泌规律的影响

由图 2(以添加质量分数为 0.000 5的葡萄糖为例)与图1(基础对照)间比较分析表明,添加葡萄糖,对βG酶的分泌规律影响较小,均是先缓慢上升后达到一定的峰值后便趋于稳定;Cx酶活经过高峰期后有较明显的下降趋势,稳定性不如基础对照组;C1酶的峰值期明显提前,且经一定的峰值稳定期后略微下降,而基础对照则无下降现象。

2.3 蛋白胨对绿色木霉产纤维素酶特性及酶系分泌特性的影响

2.3.1 蛋白胨对酶系各组分最高酶活、比酶活及其形成时间的影响

表 5表明,发酵液中添加蛋白胨,最高酶活以 C1和 Cx酶有不同程度的增加,分别为 0.9%～199.6%和 2.1%～45.1%,增加效应有明显的质量分数依赖性,最佳质量分数分别为 0.004和 0.000 5;βG酶降低 5.9%～34.2%,随质量分数增加降低程度增加,质量分数为 0.01时最显著。Cx酶最高酶活形成时间均由 10 d缩短至 4 d;C1酶缩短为 4～7 d,随添加质量分数增加缩短程度增加;βG酶在质量分数大于0.008时才略微缩短。比酶活以βG酶降低最显著(降低 35.2%～87.3%);C1和 Cx酶因质量分数不同而增减不一,均以质量分数为 0.000 5时最高 (分别提高 50.0%和 65.4%),总体上各组分有随质量分数增加而降低的趋势。

表 5 蛋白胨对绿色木霉 3.3711产纤维素酶系各组分最高酶活、比酶活及其形成时间的影响

2.3.2 蛋白胨对酶系形成过程中各组分分泌规律的影响

由图 3(以添加质量分数为 0.002的蛋白胨为例)与图 1(基础对照)间比较分析表明,蛋白胨对βG酶分泌规律几乎无影响,但对 C1和 Cx酶的分泌规律影响极大,两者均出现了一个极为明显的峰值,且峰值期极短,峰值后均出现了两次明显的下降。

图 3 质量分数 0.002蛋白胨对绿色木霉 3.3711纤维素酶系分泌特性的影响

3 讨论

自然界中的纤维素是目前地球是最为丰富和最具有潜力的可利用资源之一,利用纤维素酶的降解作用是合理利用纤维素资源的环保途径,但纤维素酶的产量和酶解效率成为了这一途径的“瓶颈”[1]。真菌类微生物是国内外用于研究和生产纤维素酶的最主要的途径,木霉属中的绿色木霉就是其中的主要代表。绿色木霉纤维素酶属于胞外酶,是一种含有 C1、Cx和βG酶三种组分酶的复合酶体系,纤维素最终降解为葡萄糖需要三种酶的协同作用。为有效提高绿色木霉纤维素酶的产量和该酶系的协同作用效果,需要对三种组分酶的分泌规律进行深入了解,本试验通过液体发酵的方法,动态地分析了三种组分酶在发酵过程中的形成规律以及葡萄糖和蛋白胨的影响效应。

从一些研究报道分析[4-5,7-10],绿色木霉纤维酶系的三种组分酶在发酵过程中的形成规律是不同的,存在着明显的时差性 (这可能是因为纤维素在不同分解时期所形成的不同产物对不同酶组分所起的反馈作用——诱导或阻遏[6]有不同),其中的 Cx和C1酶一般在 4～5 d即达到了较高的分泌量,而βG酶则在 8～9 d后才出现较高酶活,这在本研究中 (图1～图 3)也得到了充分的证实。由此可以进一步阐明,从不同发酵时间的发酵液中获取的纤维素酶系间会存在 C1、Cx和βG三种组分酶的比例差异较大的现象,出现明显的不均一性,进而导致同一发酵底物生产的酶系的酶解效率的差异性。以基础培养基产生的酶系为例 (图 4),发酵 4 d时三种组分酶活分别为 15.5、158.6和 7.7 u/mL,而 10 d时分别为52.6、185.2和 79.3 u/mL,其中 βG酶活占 Cx酶活的比例分别为 4.9%和 42.8%,差异极为显著。由此,以前一些报道中关于绿色木霉纤维素酶系中βG酶活偏低的结论是存在一定的片面性的[11-12],也不能以单一组分酶代表整个酶系。故应按一种动态分析法对酶系各组分进行考虑,才能较为真实地反映出纤维素酶系的形成特性和酶解能力。

图 4 基础培养基不同发酵时间纤维素酶系各组分酶活

根据以上分析,为更加全面的了解绿色木霉纤维素酶系的分泌特性,有必要进一步探讨一些因素如培养基组分、营养添加物、培养条件等对其分泌特性的影响。一些研究者[7-8,13-14]报道了发酵液 pH、碳源 (葡萄糖、纤维素、稻壳、麦麸等)、氮源 (尿素、酵母膏、蛋白胨等)、表面活性剂 (鼠李糖脂、吐温 80等)、接种量等对不同组分酶活、形成变化规律和比酶活等部分特性的影响,本研究更加全面地分析了具有代表性的碳源 (葡萄糖)和氮源 (蛋白胨)对最高酶活、比酶活及最高酶活形成时间的影响,结果显示,质量分数为 0.000 5～0.003的葡萄糖显著降低了三种组分酶的最高酶活、C1和 Cx的最高酶活形成时间以及 C1和βG比酶活;质量分数为 0.000 5～0.01的蛋白胨明显提高了 C1和 Cx的最高酶活,降低了 C1和 Cx的最高酶活形成时间及βG的最高酶活和比酶活,对 C1和 Cx的比酶活的增减效应存在浓度依赖性;两种物质对βG最高酶活形成时间均未产生明显影响。说明添加物的种类和浓度对纤维素酶系的不同组分和分泌特性指标的影响效应均在显著的差异性。

从图 1～图 3中各组分酶的分泌变化曲线分析,在发酵液中添加葡萄糖和蛋白胨,C1和 Cx酶均有较大的可变性,而βG酶则相对稳定具有一定稳定性,这提示通过添加营养添加剂的措施可以较好地对 C1和 Cx酶进行调控。特别值得提出的是,从图 2～图 3还发现,两种添加物对 C1和 Cx酶活形成峰值的稳定性也产生了明显影响,特别是蛋白胨对 Cx酶活的影响极为显著,第 4 d达到峰值时的酶活为213.0 u/mL,而第 3、5 d则仅为 55.3、141.6 u/mL。说明蛋白胨在明显提高 Cx酶活峰值的同时,却大大缩短了峰值稳定期。这对于生产来说是极为不利的性质,要求准确控制发酵时间才能达到良好的提高酶活效果,需进一步研究既能提高酶活峰值又能延长峰期稳定性的添加剂或发酵措施等。

综合以上分析,在发酵液中添加一些营养物是完全能够改变绿色木霉纤维素酶系各组分的分泌特性的。可以根据不同的实际生产需要,有针对性的利用一些营养性培养基或代谢调节添加剂、改变发酵条件或调整发酵工艺等调控途径进行生产,达到专一提高纤维素酶系中某单一组分酶 (如 Cx酶)的产量或改善酶系中不同组分间的均衡性等目的。

4 结论

通过两因素多水平正交试验分析出,绿色木霉3.371 1液体发酵产纤维素酶系中 C1、Cx和βG酶的最适作用条件分别为 (pH 5.0,45℃),(pH 3.5,55℃)和(pH 4.5,65℃)。在液体发酵和基础产酶培养基条件下,三种组分酶的最高酶活分别为53.6、185.2和 79.3 u/mL,比酶活分别为 46.6、167.7和71.8 u/mg,最高酶活形成时间分别为 9、10和10 d。发酵液中添加质量分数为 0.000 5～0.003的葡萄糖显著降低了三种组分酶的最高酶活、C1和 Cx的最高酶活形成时间以及 C1和βG比酶活;添加质量分数为 0.000 5～0.01的蛋白胨明显提高了 C1和 Cx的最高酶活,降低了 C1和 Cx的最高酶活形成时间及βG的最高酶活和比酶活,蛋白胨对 C1和 Cx比酶活的增减效应存在浓度依赖性。两种添加物均能明显改变 C1和 Cx酶的分泌变化规律,对βG酶影响极小。

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Effects of Glucose and Peptone on Characteristics of Cellulase System Induced by Trichoder ma Viride

Dai Sifa1He Yancai2
(College ofAnimal Science,Anhui Science and TechnologyUnivesity1,Fengyang 233100)
(College ofMaterial Science and Engineering,Huaqiao University2,Quanzhou 362011)

By adopting orthogonal test,the optimal enzymolysis condition for respective components of cellulase system from Trichoder ma viride 3.3711 induced liquid fermentation are found to be pH 5.0,45℃for enzyme C1,pH 3.5,65℃for enzyme Cx,and pH 4.5,65℃for enzymeβG.Under the condition of liquid state and basic cul2 tivation fermentation,the highest enzyme activity(HEA)of the three components are 53.6,185.2 and 79.3 u/mL,enzyme activity ratio(EAR)are 46.6,167.7 and 71.8 u/mg,formation time of highest enzyme activity(FTHEA)are 9,10 and 10 d,respectively.Addition of 0.05%～0.3%glucose leads to decreasing HEA of the three compo2 nents by 27.4%～38.4%,25.5%～35.5%and 14.0%～52.3%,shortening FTHEA of C1 and Cx to 4～7 and 5 d,and decreasing EAR of C1 andβG by 20.8%～35.4%and 25.8%～64.5%,respectively.Addition of 0.05%～1.0%peptone leads to increasing HEA of C1 and Cx by 0.9%～199.6%and 2.1%～45.1%,shorten2 ing FTHEA of C1 and Cx to 4～7 and 4 d,and decreasing HEA and EAR ofβG by 5.9%～34.2%and 35.2%～87.3%,respectively.The effects of peptone on EAR of C1 and Cx are concentration dependent and concentration 0.05%leads to increasing the effects by 50.0%and 65.4%,respectively.Regarding to the rule of enzyme secretion of respective components,glucose and peptone both show a certain effect on C1 and Cx and few effect onβG.

Trichoder ma viride,cellulase system,secretory characteristic,glucose,peptone

Q556.03

A

1003-0174(2010)02-0107-06

2009-02-26

戴四发,男,1973年出生,副教授,动物营养与饲料