花生短肽脱盐工艺研究

张宇昊 马 良 谢 祥 王 强

(西南大学食品学院1,重庆 400715)

(中国农业科院农产品加工研究所2,北京 100094)

花生短肽脱盐工艺研究

张宇昊1马 良1谢 祥1王 强2

(西南大学食品学院1,重庆 400715)

(中国农业科院农产品加工研究所2,北京 100094)

对花生短肽脱盐方法进行了系统研究,比较了阴阳离子交换树脂法、大孔树脂法和阴阳离子混合床法的脱盐效果,结果显示,阴阳离子混合床脱盐法效果最优。在此基础上,对花生短肽阴阳离子混合床脱盐工艺进行优化,确定了花生短肽脱盐较优参数组合为:水解液过柱速度为 5～10倍柱体积/h、水解液初始pH值 4.5、阴阳离子树脂比例为 3:2,在此条件下花生短肽脱盐率和回收率均大于 80%。成分测定结果表明,脱盐后花生肽纯度达到 90.25%。

花生短肽 脱盐 混合床

花生是我国六大油料作物之一,产量高居世界首位。目前,中国对花生的利用主要是食用油脂的提取,对花生蛋白的利用较少。采用生物酶法在温和条件下对蛋白进行水解,生成的多肽具有很高营养价值。现代营养研究表明[1-4]:分子量小于1 000 Da的短肽极易被人体吸收利用,而且具有较强的功能活性。因此以花生蛋白为原料开发高附加值的花生短肽产品可大大促进我国花生蛋白深加工产业的发展。

短肽的制备通常采用蛋白质酶解法[5],花生蛋白酶解过程中,为了使蛋白酶处于最适 pH范围内,尽量维持其水解速度,必须不断加入一些碱或酸来调节水解体系的 pH值,因此最后得到的蛋白水解物中含有一定量的盐分,这部分盐分可能会影响到产品的纯度和适用范围并对其功能活性带来负面影响[6],进而限制其在食品领域的应用,因此需要对花生短肽进行脱盐处理。

传统的脱盐方法包括离子交换树脂脱盐法和大孔树脂法[7-10]。离子交换树脂脱法要分别通过阴阳离子交换树脂,使得脱盐过程较为繁琐,且肽回收率较低。这是因为在水解液经过阳离子树脂时,溶液体系表现为酸性,使得大量肽分子在溶液中带正电荷,从而造成肽的损失较大,经过阴离子树脂时亦然。大孔树脂法则要经过吸附和洗脱过程,不仅操作繁琐,肽得率较低,而且洗脱时要使用有机溶剂,使得该法不易实现产业化。

针对传统脱盐方法短肽得率较低等方面的问题,对短肽脱盐技术进行改良,以期获得高脱盐率、高短肽得率的脱盐方法,为花生短肽的产业化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要原料和试剂

冷榨花生蛋白粉:青岛长寿集团;Alcalase:Novo公司;N120p:Kerry公司;001×7型阳离子交换树脂,D301-G型阴离子交换树脂、DA201-C大孔树脂、江阴苏青水处理公司;福林 -酚试剂:Sigma公司。

1.2 主要设备

HD-21-88自动核酸蛋白分离层析仪:上海奇特分析仪器有限公司;CS501-SP超级数显恒温器:重庆四达试验仪器有限公司;UV—1201紫外分光光度计:北京瑞利分析仪器公司;微型旋涡混合仪:上海沪西分析仪器厂。

1.3 分析方法

1.3.1 花生蛋白的制备

冷榨花生蛋白粉→碱溶 (料水比 1∶10,25℃,25 min,pH 8.5)→离心 (800×g,5 min)→上层清液→酸沉 (pH 4.5)→离心 (4 200×g,15 min)→冷冻干燥[7]。

1.3.2 花生短肽的制备

将花生蛋白溶于水中,搅拌溶解,用 Alcalase与N120p双酶分步水解,酶解过程中不断用 1 mol/L NaOH维持酶解所需 pH不变;酶解完毕后将水解液加热至 90℃,保温 20 min进行灭酶处理;4 200 g离心 15 min;冷冻干燥备用。

1.3.3 阴阳离子交换树脂脱盐

阴阳离子交换树脂于水中浸泡处理 24 h后装柱,然后分别用 7.5%HCl和 10%NaOH对其进行处理,转化为 H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂,再用水清洗至微酸性或微碱性待用。

将所得花生蛋白水解液,以 10倍柱体积 /h的流速通过 H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子,待流出液 pH=4.0时停止加样,之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子,至流出液呈弱酸性加样[11]。1.3.4 大孔树脂法脱盐1.3.4.1 静态吸附试验

于 100 mL具塞锥形瓶中加入 5.0 g树脂,一定质量浓度 (20 mg/mL)的水解液 40 mL,用塞子塞好,振荡均匀,将该锥形瓶放入 4℃水域恒温振荡器中振荡 (160 r/min)24 h,至吸附平衡,按下式计算吸附量[8]:

式中:A为吸附率;C0为起始质量浓度/mg/mL;Ce为平衡质量浓度 /mg/mL。1.3.4.2 静态解吸试验

将吸附上水解液的树脂从吸附体系中通过过滤分离出来,然后选择一定浓度的乙醇作为洗脱剂,对吸附了活性肽的树脂进行洗脱,按下式计算洗脱率:

式中:D为解吸率;VD为洗脱液体积/mL;C1为解吸液质量浓度/mg/mL;V为脱盐料液的体积 /mL。

1.3.5 混合床脱盐

将花生水解液通过混合床进行脱盐,基本条件为阴离子∶阳离子 =3∶2,过柱速度:5倍柱体积 /h,水解液 pH值 4.5,改变其中一个条件,固定其他条件以分别考察各因素对水解液脱盐效果及蛋白回收率的影响。各因素水平梯度分别为阴离子 ∶阳离子1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1;过柱速度:2倍、5倍、10倍、15倍柱体积 /h;水解液 pH值:3.5、4.5、5.5、6.5、7.5。

式中:M1为脱盐后盐分含量/mg;M0为脱盐前盐分含量 /mg。

1.3.8 花生短肽成分测定

蛋白质测定:GB/T 5009.5—2003;脂肪测定:GB/T 5009.6—2003;灰分测定:GB/T 5009.4—2003;总糖测定:苯酚 -硫酸法[14]。

式中:N1为脱盐后短肽含量/mg;N0为脱盐前短肽含量 /mg。

1.3.7 脱盐率测定

盐分含量采用灰分法 G B/T 5009.4—2003测定。

1.3.6 短肽得率测定

短肽含量采用 Lowry法[12-13]测定。

2 结果与讨论

2.1 花生短肽脱盐方法的选择

将三种花生短肽脱盐方法进行对比,结果如图 1所示。

图 1 脱盐方法的比较

花生肽经混合床处理后,其脱盐率为 (82.19±0.75)%,与经大孔树脂处理的样品相比没有差异(P>0.05),但脱盐效果在 P<0.05水平下显著好于阴阳离子分别处理的样品;从短肽回收率的结果来看,采用混合床法脱盐后样品短肽得率达到(77.39±0.96)%,显著高于大孔树脂法和阴阳离子树脂法处理后的样品 (P<0.05)。

采用阴阳离子树脂法脱盐时,水解液经过阳离子树脂时,整个溶液体系表现为酸性,使得大量肽分子在溶液中带正电荷并被吸附于树脂上,经过阴离子树脂时亦然;另外一些肽分子还会吸附于树脂的孔径之上,因此采用阴阳离子树脂分别脱盐时会造成短肽损失较大。一些文献报道通过增加过柱速度可降低短肽的损失,但试验结果证明,采用 10倍柱体积 /h的流速并没有达到满意的短肽回收率,反而造成其脱盐率显著低于混合床脱盐法 (P<0.05)。

大孔树脂是 20世纪 60年代发展起来的一类非离子型高分子吸附剂,是基于化合物的疏水集团与非极性吸附剂之间的范德华力和静电引力,其结合力的大小与各种生物分子的结构以及吸附树脂的性质密切关系,对水溶性化合物的分离具有较好的效果[15-16]。利用大孔树脂脱盐主要是利用短肽中的疏水性残基可以从水相中通过疏水作用吸附到树脂的疏水表面和网络空穴内部,由此将短肽与盐分离,再通过有机溶剂洗脱来重新得到短肽。试验结果表明,大孔树脂脱盐效果令人满意,但是短肽得率仍然偏低,另外操作过程中需采用有机溶剂洗脱,造成了这一技术的推广前景不乐观。

混合床技术主要用于水处理,用于短肽脱盐尚未见报道。试验结果证明,采用混合床对花生肽脱盐无论是脱盐率还是短肽得率均较高,这是因为水解液在脱盐过程中 pH比较稳定,大大减少了脱盐过程中肽的损失;另外阴阳离子之间的相互作用会使树脂对短肽的吸附程度降低,可见混合床脱盐在短肽得率方面同前两种方法相比有明显优势,因此选用混合床对花生短肽进行脱盐。

2.2 混合床脱盐参数的选择

2.2.1 过柱速度的确定

过柱速度对蛋白质回收率及脱盐率都有影响,过柱速度过快会造成样品与树脂接触时间短,从而脱盐率降低;过柱速度过慢会造成样品与树脂接触时间过长,从而短肽回收率降低。花生蛋白水解液以不同的过柱速度通过树脂,收集流出液,测定蛋白质回收率和脱盐率。试验结果如图 2所示,当过柱速度为 10倍柱体积 /h时,蛋白回收率为 85.99%,与流速为 15倍柱体积 /h时没有差异 (P>0.05);脱盐率为 81.62%,与流速为 5倍柱体积 /h时没有差异(P>0.05)。因此综合考虑,在实际生产中,水解液过柱速度可选择 5～10倍柱体积 /h。

图 2 过柱速度的选择

2.2.2 酶解液 pH值的确定

酶解液的 pH值会影响体系离子化程度,当其离子化程度较低时,短肽损失少,反之,损失较大。由图 3可知,水解液 pH对短肽脱盐率影响不大,但是对短肽得率影响较大,当 pH值为 4.5时短肽得率最高,可达 82.89%,而在其他 pH下进行混合床脱盐,短肽得率均小于 80%,因此选择 pH 4.5为较优 pH。

图 3 水解液 pH值的选择

2.2.3 阴阳离子交换树脂比例的确定

离子交换树脂的比例对脱盐和短肽得率都会产生影响,比例不适当会造成水解液中的盐分无法完全脱除;还会使体系 pH发生较明显变化进而造成短肽得率降低。由图 4可知,阴离子树脂∶阳离子树脂为 3∶2和 2∶1时,脱盐率分别达到 85.17%和82.85%,显著高于其他水平 (P<0.05),阴阳离子树脂比例为 3∶2时的短肽得率为 83.2%,显著高于阴离子树脂∶阳离子树脂为 2∶1时的短肽脱盐率 (P<0.05)。因此选择阴阳离子树脂比例为 3∶2为较优树脂比例。

图 4 树脂比例的选择

2.3 花生短肽成分测定

脱盐后的花生短肽经测定组分见表 1,大豆肽行业标准规定,一级大豆肽的纯度需达到 80%以上 (干基),经脱盐后,花生肽纯度达 90%,高于一级肽的标准。

表 1 花生短肽的组成 (干基)

3 结论

3.1 建立了阴阳离子交换树脂混合床脱盐法,最适操作条件为:水解液过柱速度为 5～10倍柱体积 /h、水解液 pH值 4.5、阴阳离子树脂比例为 3∶2,花生短肽脱盐率和蛋白回收率均大于 80%。

3.2 脱盐后花生肽纯度达到 90.3%。

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Desalinization Process of PeanutOligopeptide

Zhang Yuhao1Ma Liang1Xie Xiang1Wang Qiang2
(Food College of SouthwestUniversity1,Chongqing 400715)
(Institute of Processing forAgricultural Products,Chinese Academy ofAgricultural Sciences2,Beijing 100094)

The different desalting methods of peanut oligopeptide,including cation-anion exchange resins,macroporous resin andmixed bed,were studied.Themixed bedwasproved to be the bestone.On the basis,the de2 salting process of peanut oligopeptide by cation-anion exchange resinsmixed bed was opti mized to improve product purity.Results:The obtained opti mum conditions are hydrolyte flow rate 5～10 BV/h,initial pH value of hydrolyte 4.5 and ratio of anion/cation exchange resins 3∶2.The desalting rate and oligopeptide recovery rate are all above 80%,better effect than the traditional desaltingmethod.The purity of the desalting peanutoligopeptides is90.25%.

peanut oligopeptides,desalinization,mixed bed

TS214.2

A

1003-0174(2010)02-0117-04

科技部“十一五”科技支撑计划项目 (2006BAK02A07-2)

2009-03-02

张宇昊,男,1978年出生,副教授,博士,农副产品加工

王强,男,1965年出生,研究员,功能食品加工和全程质量控制