大孔树脂分离纯化花生壳总黄酮的研究

张 斌 孙兰萍 马 龙 赵大庆 许 晖

(蚌埠学院食品与生物工程系1,蚌埠 233030)

(合肥工业大学生物与食品工程学院2,合肥 230009)

大孔树脂分离纯化花生壳总黄酮的研究

张 斌1,2孙兰萍1马 龙1赵大庆1许 晖1

(蚌埠学院食品与生物工程系1,蚌埠 233030)

(合肥工业大学生物与食品工程学院2,合肥 230009)

为了分离纯化花生总壳黄酮,比较了 8种大孔树脂的静态吸附过程,筛选出了适合吸附花生壳总黄酮的树脂。研究了花生壳总黄酮在大孔吸附树脂上的动态吸附特性,并确定分离花生壳总黄酮的适宜工艺条件。结果表明:AB-8大孔树脂对花生壳总黄酮有较好的吸附分离性能,其对花生壳总黄酮的静态吸附平衡时间为 4 h;AB-8型大孔树脂对花生壳总黄酮有较好的吸附和解吸效果;较优的吸附分离工艺参数为:样液 pH值 6.0,上样液流速 1 mL/min,上样液质量浓度 0.5 mg/mL,用 70%乙醇洗脱时,解吸率达94.23%,3 BV洗脱液基本上能将花生壳总黄酮洗脱下来。

花生壳 总黄酮 大孔树脂 分离纯化

花生 (Arachis hypogaea L.)属豆科一年生草本科植物,是我国重要经济作物。花生壳是其荚果外壳,在加工过程中每年产生约 450万 t,除了很少部分被用于饲料加工、食用菌栽培、化工原料或药品生产等外,绝大部分都被当作燃料或废弃物,资源利用率非常低,其资源开发尚有很大的潜力[1-2]。研究表明花生壳中除含有碳水化合物和粗纤维外,还含有黄酮类物质[3]。现代科学研究证明花生壳黄酮具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌症、抗衰老、抑制高血压高血脂及预防心血管疾病等多种药理作用[4-5]。因此,对花生壳黄酮化合物的研究与利用越来越受到人们的重视,其在食品、医药、保健品和化妆品等领域也将具有广阔的应用前景[6-7]。目前花生壳黄酮类物质主要采用水浸提,碱性水浸提和乙醇等溶剂法提取[8-9],粗提物中普遍存在黄酮物质含量较低、有机溶剂残留等缺点,需进一步分离纯化,以提高黄酮的纯度。

大孔树脂是 20世纪 60年代发展起来的一类新型高分子材料,90年代后其应用日趋广泛。大孔树脂是国家“十五”期间重点推广的新技术,具有吸附容量大、吸附速度快、分离效果好、再生简便等优点[10-14],广泛应用于植物天然活性成分的分离和纯化[13-15]。目前对花生壳有效成分的提取和分离纯化缺乏系统研究,国内外文献报道不多。在前期对花生壳总黄酮提取研究的基础上[8,16],选择 8种大孔树脂,比较其对花生壳总黄酮的吸附量和解吸率,从中筛选出较优的大孔树脂并对其动态吸附和解吸性能进行考察,以期为综合利用花生壳资源,开发黄酮类制品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生壳:花生果产于安徽省,手工剥壳,粉碎后备用。芦丁 (生化试剂,国药集团化学试剂有限公司);大孔树脂 (树脂 LSA-10、LSA-21):西安深蓝公司 ;树脂 AB-8、S-8、DA-201、DM-301、HPD-100和 X-5:天津南开大学化工厂。8种大孔树脂的物理性能见表 1。

表 1 大孔树脂的物理性能

1.2 仪器

UV1102型紫外可见分光光度计:北京瑞利分析仪器公司;RE-52A旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;BSZ-160自动部分收集器:上海青浦沪西仪器厂;HL-2恒流泵:上海青浦沪西仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 花生壳黄酮提取液的制备

将新鲜成熟的花生壳清洗,晾干,粉碎过 40目筛,称取粉碎花生壳 200 g,置于 1 000 mL圆底烧瓶中,注入占烧瓶 1/2体积的乙醇,接上回流冷凝管,于水浴中加热回流 3 h,过滤后残渣再用 1 000 mL乙醇提取 2次,合并滤液,用旋转蒸发器浓缩至无乙醇味,过滤得到花生壳总黄酮粗提液。

将样品溶液稀释至一定浓度,准确吸取 1 mL于25 mL容量瓶中,与标准曲线同法操作测定吸光度,带入回归方程计算样品溶液总黄酮含量。

1.3.2 标准曲线和回归方程的建立

采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[15]。准确称取干至恒重的芦丁标准品 0.020 g,用 60%乙醇溶解,定容于 100 mL容量瓶,得质量浓度为 0.20 mg/mL芦丁标准液。准确吸取芦丁标准溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于 10 mL容量瓶中 ,加入 5%的 NaNO2溶液 0.3 mL还原 6 min,加入 10%的 Al(NO3)3溶液 0.3 mL络合 6 min,加入质量分数为4%(即 1 mol/L)的 NaOH溶液 4 mL,最后用 30%乙醇定容,摇匀,显色 15 min,在波长 510 nm处测定吸光度,计算得芦丁溶液浓度 C(mg/mL)相对于吸光度A间的回归方程为:A=11.589 0C+0.010 2,R2=0.998 1。

1.3.3 大孔树脂的预处理

将新大孔树脂用 95%的乙醇浸泡 24 h使其充分溶胀,然后用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象,用蒸馏水除去乙醇;再用 5%盐酸浸泡 12 h,除去破碎的颗粒,用 3 BV(柱床体积)的 5%HCl溶液以 5 BV/h的流速冲洗树脂,用蒸馏水洗至中性;最后用 5%NaOH浸泡 12 h,除去破碎的颗粒,用3 BV的 5%NaOH溶液以 5 BV/h的流速冲洗树脂,蒸馏水洗至 pH值为中性[15,17]。

1.3.4 静态吸附解吸试验[15,18]

1.3.4.1 吸附量的测定

准确称取经预处理后抽干的 8种树脂各 0.5 g装入具塞磨口三角瓶中,分别加入一定浓度花生壳总黄酮水溶液 50 mL,于电动振荡器中,在室温下以100 r/min的频率振荡吸附 24 h,过滤,测定滤液中剩余花生壳总黄酮浓度,按式 (1)计算各种树脂室温下的吸附量。

式中:Q为吸附量/mg/g;C0为起始浓度,mg/mL;Ce为平衡浓度/mg/mL;V为加入样品液体积 /mL;W为树脂湿重 /g。

1.3.4.2 解吸率的测定

将吸附处理好的 8种树脂置锥形瓶中,分别加入 95%乙醇 20 mL,于吸附相同的条件下振荡 12 h,过滤,测定滤液中花生壳黄酮浓度,按式 (2)计算树脂的解吸率。

式中:D为解吸率/%;Cx为解吸液中花生壳总黄酮浓度 /mg/mL;Vx为解吸液体积 /mL。

1.3.4.3 静态吸附动力学特性的测定

在比较各树脂的吸附量和解吸率的基础上,选择 2种较适合的树脂测定其吸附速率。准确称取滤纸吸干的大孔树脂 0.5 g装入具塞磨口三角瓶中,精密加入已知浓度的花生壳总黄酮水溶液 50 mL,置恒温振荡器上以 100 r/min的频率振荡,在 6 h内,每小时各取 0.5 mL,测定总黄酮含量,绘制静态吸附动力学曲线。

1.3.4.4 上样液 pH值选择

准确称取静态试验所筛选的树脂 0.5 g于具塞磨口三角瓶中,分别加入不同 pH值的花生壳总黄酮水溶液 50 mL,其余同 1.3.4.1。

1.3.5 动态吸附 -洗脱工艺参数测定试验

通过静态吸附试验,筛选出一种较优的树脂,对其进行上样液流速、浓度、洗脱剂浓度及解吸曲线等的考察[18]。将预处理好的树脂装入1.2 cm×20 cm色谱柱中,将花生壳总黄酮水溶液调 pH值至最佳范围,然后上柱,控制一定流速,分步收集 (5 mL/管),当流出液的总黄酮浓度达泄漏点 (即达上样液总黄酮浓度的 1/10)时,认为总黄酮已透过,停止上样。

2 结果与讨论

2.1 大孔树脂静态吸附解吸试验结果

2.1.1 不同大孔树脂的吸附量和解吸率

由表 2可以看出,弱极性和极性树脂的吸附能力较强,而非极性树脂的吸附能力较差,这与花生壳黄酮具有的多酚结构和糖苷键结构有关,具有一定的极性和亲水性,生成氢键的能力较强,有利于弱极性和极性树脂对其吸附。此外,树脂吸附能力还与孔径、比表面积、孔容等物理结构参数有关。由表 2还可以看出,AB-8、LSA-10、S-8三种树脂的吸附量都较大,其中 S-8树脂吸附量较大,但解吸率太低,说明树脂与花生壳黄酮结合能力较强,不利于后续黄酮类物质的解吸;综合比较,AB-8、LSA-10对花生壳总黄酮的吸附量和解吸率都较高,所以 AB-8、LSA-10是较适用于花生壳总黄酮吸附分离的大孔树脂类型。

表 2 不同树脂的吸附量与解吸率

2.1.2 大孔树脂的静态吸附动力学特性

选择较为合适的 AB-8、LSA-10树脂进行静态吸附动力学试验,其静态吸附动力学曲线如图 1所示。

图 1 大孔树脂的静态吸附动力学曲线

从静态吸附动力学曲线可以看到,AB-8和LSA-10树脂对花生壳总黄酮的吸附随时间延长而吸附效果明显增强,花生壳总黄酮在这2种树脂上的动力学过程基本相似,但在吸附量上有一定差别;由图 1同时可以看出,2种树脂对花生壳总黄酮的吸附为快速平衡型,即起始阶段吸附量都较大,到 4 h后,吸附量变化平稳,其静态吸附基本达到平衡。但从总体上来看,AB-8树脂的吸附量优于 LSA-10树脂。

2.1.3 上液样 pH值的影响

选择 AB-8大孔树脂,考察花生壳总黄酮水溶液 pH值为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和 8.0时对吸附性能的影响,结果如图 2所示。可以看出,一定的酸性条件有利于花生壳黄酮的吸附,其原因可能是当pH值较小时,溶液中黄酮类物质的糖苷键容易水解,影响树脂对它们的吸附;随着 pH值增大,黄酮类化合物在酸性条件下以分子状态存在,主要以范德华力与树脂进行物理吸附;而在碱性条件下,以离子状态存在,不易与树脂发生物理吸附作用,因此确定吸附 pH值 6.0为宜。

图 2 pH值对吸附特性的影响

2.2 大孔树脂动态吸附 -洗脱工艺参数优化

2.2.1 上液样流速的影响

花生壳总黄酮水溶液质量浓度为 0.5 mg/mL,温度 20℃,pH值 6.0,分别控制柱流速为 0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min,每 10 mL收集流出液,测定流出液中花生壳总黄酮的质量浓度,绘制动态动力学曲线,如图 3所示,研究流速对树脂吸附动态动力学曲线的影响,确定合适的操作流速。

图 3 不同流速下总黄酮在AB-8树脂上的动态吸附曲线

由图 3可以看出,吸附流速为 0.5 mL/min和1.0 mL/min时泄漏点出现较晚,在 180 mL附近,其原因可能是流速较慢时花生壳总黄酮与树脂接触的时间较长,有利于其从液相扩散到树脂内部,从而提高了吸附率。随着流速增大到 2.0 mL/min,漏出点出现较早,大约在 140 mL附近,可能是由于流速过快,花生壳总黄酮来不及被树脂吸附就随渗透液流出,因此流速慢有利于吸附,但流速过慢,导致生产周期长,吸附效率低,不利于工业化生产。综合考虑,选择流速为 1 mL/min为较佳吸附流速。

2.2.2 上样液质量浓度的影响

流速 1.0 mL/min,温度 20℃,pH 6.0,上样液黄酮质量浓度分别为 0.3、0.5、0.7 mg/mL,测定吸附后流出液中花生壳总黄酮的质量浓度,绘制动态动力学曲线,如图 4所示,研究花生壳总黄酮质量浓度对树脂吸附动态动力学曲线的影响。

图 4 不同样液浓度下总黄酮在AB-8树脂上的动态吸附曲线

由图 4可以看出,当花生壳总黄酮质量浓度为0.3 mg/mL和 0.5 mg/mL时,吸附动态动力学曲线比较靠近,在一定范围内,吸附量随花生壳总黄酮质量浓度的增大而增大,但随黄酮质量浓度继续增大,传质速度变慢,且树脂周围的黄酮分子过多,使得部分黄酮没来得及被吸附就流出来,且泄漏提前,树脂的吸附量降低。在实际工作中,选择合适的花生壳总黄酮浓度将有利于提高 AB-8大孔树脂的吸附性能。因此,上样质量浓度确定为 0.5 mg/mL。

2.2.3 洗脱剂体积分数的影响

将吸附花生壳总黄酮饱和了的树脂 0.5 g装入三角瓶中,分别加入 30%、40%、50%、70%和 95%乙醇 20 mL,置于恒温摇床中振摇 24 h后,测定各解吸液中总黄酮量,计算解吸率,结果如图 5所示。可以看出,随着乙醇体积分数增加,树脂吸附的黄酮脱附量开始迅速增加,到乙醇体积分数 60%后,增加幅度缓慢,当乙醇体积分数 70%时,解吸率达到 94.23%,继续提高乙醇体积分数,黄酮解吸率反而减小,可能是乙醇体积分数大于 70%后,其他杂质容易一起洗脱下来影响解吸液中黄酮化合物的含量,因此选用 70%乙醇洗脱黄酮。

图 5 洗脱剂体积分数对解吸率的影响

2.2.4 动态解吸曲线

吸附饱和的 AB-8树脂,采用 3 BV 70%的乙醇洗脱,洗脱速度 1.0 mL/min,收集流出液 (5 mL/管),分别测定总黄酮浓度,结果见图 6。

图 6 动态解吸曲线

由图 6可以看出,动态条件下 AB-8树脂上吸附的花生壳总黄酮极易洗脱,只用很少量的洗脱剂即可使树脂柱上吸附的总黄酮洗脱下来。采用 70%的乙醇解吸时,洗脱峰集中,对称性好,无拖尾现象,3 BV 70%乙醇基本上可将花生壳总黄酮洗脱下来。

3 结论

3.1 通过对 8种大孔树脂的静态吸附研究,发现AB-8型大孔树脂是一种比较理想的树脂,吸附率大,解吸率高,较适合花生壳总黄酮的分离纯化。

3.2 当上液样 pH值为 6.0,上样液质量浓度为 0.5 mg/mL,上样流速为 1 mL/min时,AB-8树脂对花生壳总黄酮的吸附量为 9 mg/mL。

3.3 当用 70%的乙醇作为花生壳总黄酮的洗脱剂时,解吸率达 94.23%,且洗脱峰集中,对称性好,无拖尾现象,用 3BV的 70%乙醇基本上能将花生壳总黄酮洗脱下来。

[1]李明妹,姚开,贾冬英,等.花生功能成分及其综合利用[J].中国油脂,2004,29(9):14-l5

[2]杨伟强.花生壳在食品工业中的综合开发与利用[J].花生学报,2003,32(1):33-35

[3]许晖,孙兰萍,张斌,等.花生壳黄酮类化合物的研究进展 [J].农产品加工 (学刊),2008,(3):11-15

[4]杨国峰,周建新,汪海峰,等.花生壳提取物的制备及其抗氧化与抗菌活性的研究进展[J].食品与发酵工业,2007,33(2):97-101

[5]Yen G Cm,Duh P D.Antioxidative Properties ofmethanolic extracts from peanut Hulls[J].Journal of the American Oil Chemists’Society,1993,70(4):383-386

[6]许晖,孙兰萍,张斌,等.花生壳提取物对油脂的抗氧化作用[J].中国油脂,2008,33(12):39-41

[7]孟阳,于丽娟.花生壳中黄酮类抗氧化的提取与及在食品中的应用[J].食品科学,1997,18(12):27-29

[8]许晖,孙兰萍,张斌,等.花生壳总黄酮乙醇提取工艺研究[J].食品工业科技,2007,28(8):135-139

[9]孙兰萍,林泽梅,许晖,等.花生壳中黄酮类化合物的提取及对油脂抗氧化作用[J].资源开发与市场,2008,24(12):1057-1059,1062

[10]古共伟,陈健,魏玺群.吸附分离技术在现代工业中的应用[J].合成化学,1999,7(4):346-353

[11]Silva EM,Pompeu D R,Larondelle Y,et al.Optimisation of the adsorption of polyphenols from Inga edulis leaves on macroporous resins using an experimental design methodology[J].Separation and Purification Technology,2007,53:274-280

[12]Yujie Fu,Yuangang Zu,Wei Liu,et al.Optimization of luteolin separation from pigeonpea[Cajanus cajan (L.)Millsp.]leaves by macroporous resins[J].Journal of Chro2 matographyA,2006,1137:145-152

[13]杜敏华,田龙.大孔吸附树脂分离纯化麦胚黄酮工艺研究[J].中国粮油学报,2007,22(3):126-130

[14]于智峰,王敏,张家峰.大孔树脂精制苦荞总黄酮工艺条件的优化研究[J].农业工程学报,2007,23(4):253-257

[15]张素华,王正云.大孔树脂纯化芦笋黄酮工艺的研究[J].食品科学,2006,27(2):182-186

[16]许晖,孙兰萍,张斌,等.响应面法优化花生壳黄酮提取工艺的研究[J].中国粮油学报,2009,24(1):107-111

[17]董娟娥,梁宗锁,张康健.大孔吸附树脂一次性分离杜仲叶中杜仲总苷和杜仲黄酮的研究[J].农业工程学报,2006,22(7):154-155

[18]叶春,阚建全,谭书明,等.鱼腥草叶总黄酮的提取分离[J].农业工程学报,2008,24(10):227-232.

Separation and Purification of Flavonoids from Peanut Hull byMacroporous Resins

Zhang Bin1,2Sun Lanping1Ma Long1Zhao Daqing1Xu Hui1
(Department of Food and Bioengineering,Bengbu College1,Bengbu 233030)
(School ofBiotechnology and Food Engineering;HefeiUniversity of Technology2,Heifei 230009)

In order to separate and purify flavones from peanut hull,the static adsorption behaviors of eight kinds ofmacroporous resin for peanut hull flavonoids(PHF)were studied and the optimum macroporous resin was screened in the presentwork.Additionally,the adsorption performance of the propermacroporous resin for PHF was researched and the optimum parametersof the adsorptionwere procured.Results:AB-8 macroporous resin is select2 ed as the optimum macroporous resin to extract and separate PHF under the experi mental condition,and the adsorp2 tion equilibrium ti me ofAB-8 for PHF is 4 h.The opti mum technological parameters of the adsorption and separa2 tion are pH 6.0,velocity of flow 1 mL/min and sample solution concentration 0.5 mg/mL.When 70%ethanol is used as eluant,the desorption capacity is 94.23%,and eluant 3 BV can desorb PHF basically.

peanut hull,flavonoids,macroporous adsorption resins,separation and purification

TS201

A

1003-0174(2010)02-0126-05

安徽高校省级自然科学研究资助项目(KJ2007B051),蚌埠学院中青年学科带头人培养对象资助项目 (院人字[2006]18号)

2009-03-01

张斌,男,1975年出生,讲师,农产品加工与贮藏

许晖,男,1969年出生,副教授,食品科学及食品生物技术