罐头食品中双酚A 和双酚 F 环氧衍生物残留的高效液相色谱分析

薛 鸣 张 虹

(浙江工商大学食品与生物工程学院,杭州 310035)

罐头食品中双酚A 和双酚 F 环氧衍生物残留的高效液相色谱分析

薛 鸣 张 虹

(浙江工商大学食品与生物工程学院,杭州 310035)

建立了一种高效液相色谱分析罐头食品中双酚 A(BPA)和双酚 F(BPF)环氧衍生物的方法。样品经微波辅助萃取后过 PPL(填料为苯乙烯 -二乙烯苯 (SDVB)聚合物)固相萃取柱进行净化试验。结果表明,微波辅助萃取法的提取效果理想;采用 PPL固相萃取回收率在 73.26%～104.98%,除杂效果明显。将微波辅助—PPL固相萃取净化法应用于多种食品进行分析,结果表明该方法适用于食品中双酚 A和双酚 F环氧衍生物残留分析。

高效液相色谱法 双酚A和双酚 F环氧衍生物 残留分析 罐头食品

罐头食品的内层表面涂有塑料制品涂料,通常用来避免罐头内层的腐蚀以及金属离子溶解食物而造成的污染。此外,该涂层还能防止罐装食物的腐烂[1]。目前,食品罐头的内层涂料通常采用环氧树脂或乙烯基有机溶胶 (聚氯乙烯,PVC)。环氧树脂一般用来合成双酚 A(BPA)和双酚 -A-二环氧甘油醚 (BADGE)。而 PVC有机溶胶树脂的制品,生产如双酚 -A-二环氧甘油醚和双酚 -F-二环氧甘油醚(BFDGE)附产物。其目的主要在于赶走在涂漆过程中因加热可能释放的盐酸[2]。残留的 BADGE,BFDGE能迁移到罐头食品中,同时多种二氯羟基混合物也可能出现。残留的环氧树脂混合物发生水解,形成 BADGE·H2O、BADGE·2H2O、BADGE·H2O·HCl、3R-NOGE(线型酚醛缩水甘油醚 )、4R-NOGE、5R-NOGE、6R-NOGE等水解产物。

双酚 A和双酚 F环氧衍生物可造成人类和动物的内分泌系统、免疫系统、神经系统出现异常,不仅具有“三致”作用,还会严重干扰人类和动物的生殖遗传功能[3-4],因此,内涂料中 BPA和 BPF环氧衍生物的分析方法已成为各国食品安全检测的研究热点。目前,对双酚类迁移物的评估基于新的毒理学数据,已在新的欧盟法规中出现。第 1895/2005号法规对某些环氧树脂衍生物在材料中使用做了限制,同时条款计划用食品联系起来,对 2种 BADGE类化合物特定的迁移物限量 (S MLs)[5]:BADGE、BADGE·H2O和BADGE·2H2O的总和在食品或食品仿制品中分别不能超过 9 mg/kg,BADGE·H2O·HCl、BADGE·HCl和 BADGE·2HCl的总和在食品或食品仿制品中分别不能超过1 mg/kg。BFDGE的限量参照 BADGE,而 NOGE则规定不得超过 0.2 mg/kg[6]。

对食品中 BPA和 BPF环氧衍生物的迁移采取措施目的在于规程的实施和保护消费者安全。目前,许多研究已开始监测罐头食品如各种含油的鱼类和海产品中双酚类物质,同时也包括多种蔬菜和水果罐头。通过广泛的调研,人们已报道了双酚类物质从多种罐头涂漆中迁移以及它们在罐头食品中固液的分布。由此可见,加大对罐头食品中 BPA和BPF环氧衍生物残留的分析具有十分重要的现实意义。研究了食品中 BPA、BPF及其环氧衍生物,建立了测定食品罐内涂料中 BPA和 BPF环氧衍生物残留的高效液相色谱分析方法[7-9]。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 试剂

凤尾鱼罐头:购自超市;双酚类物质标准品:双酚 -A-二环氧甘油醚 (BADGE,≥97%)、双酚 -A-二环氧甘油醚氢氯化物 (BADGE·HCl,≥90%)、双酚 -A-二环氧甘油醚二氢氯化物 (BADGE·2HCl,≥90%)、双酚 -A-二环氧甘油醚单水合物(BADGE·H2O,≥97%)、双酚 -A-二环氧甘油醚水合物氢氯化物 (BADGE·HCl·H2O,≥95%)、双酚 -F-二环氧甘油醚 (BFDGE,≥90%)、三环酚醛清漆甘油醚 (3R-NOGE,≥90%)、四环酚醛清漆甘油醚 (4R-NOGE,≥90%)、五环酚醛清漆甘油醚(5R-NOGE,≥90%)、六环酚醛清漆甘油醚 (6RNOGE,≥90%):美国 Sigma公司;乙腈、甲醇 (色谱纯):Merck公司;甲基叔丁基醚 (MTBE,色谱纯):TED I A公司。

1.1.2 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪,Waters 2475荧光检测器 (FLD):美国 Waters公司;超速离心机 (SOR2 VALL-RC6):美国 Thermo公司;微波萃取仪 (CEM-MARS):美国 CEM公司;固相萃取装置(Medi wax12):美国 Mediwax公司;氮吹仪 (DSY-Ⅱ型):北京金科精华苑技术研究所;涡旋振荡器 (XW-80A):上海医科大学仪器厂;聚四氟乙烯 (PTFE)微孔滤膜:天津天津市恒奥科技发展有限公司;Bond Elut PPL固相萃取柱 (填料为苯乙烯 -二乙烯苯(SDVB)聚合物):Varian公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

将各标准样品母液稀释,配制成含 BADGE、BADGE · HCl、BADGE · 2HCl、BADGE · H2O、BADGE·HCl·H2O、BFDGE、3R-NOGE、4RNOGE、5R-NOGE、6R-NOGE分别为 1.1、0.32、1.0、0.4、1.0、0.99、0.9、0.94、1.0和 1.0 mg/mL的混合标准溶液,再逐级稀释至所需质量浓度。

1.2.2 样品中分析物的提取

将样品用组织捣碎机捣碎,称取 2.0 g于 50 mL聚丙烯离心管中,加入 15 mL正己烷,50℃水浴浸提30 min,连续振摇。然后将溶液转移至微波萃取罐中,并用 8 mL丙酮清洗离心管后加入萃取罐。混匀后 105℃微波萃取 20 min。将罐中液体转移至50 mL离心管中,再加入 10 mL乙腈,振摇 5 min,静置分层 30 min,取下清液置 50 mL旋转烧瓶中,重复操作两次,合并液体。30℃旋转蒸发浓缩至干,加入3 mL水 /甲醇 (96/4,V/V)涡旋溶解备用。

1.2.3 固相萃取净化

PPL固相萃取柱依次用 4 mL甲醇和 4 mL水 /甲醇 (96/4,V/V)活化;然后将 1.2.2中的备用液上样至固相萃取柱中;用 4 mL水 /甲醇 (80/20,V/V)淋洗柱子。在溶剂流过固相萃取柱后,抽干 PPL小柱,用 5 mL乙腈溶液洗脱。洗脱液经 30℃氮气吹干后,再用 1 mL甲醇定容,密封冷藏于 4℃待测。

1.2.4 液相色谱条件

采用Waters 2695液相色谱分离,Waters 2475荧光检测器检测;色谱柱:汉邦科技 Lichrospher C18,5μm,150×2.1 mm;柱温:30 ℃;进样体积:BADGE及环氧衍生物,1μL;BFDGE及环氧衍生物,2μL;荧光检测器激发波长 (em)230 nm,发射波长 (ex)301 nm。流动相:乙腈和水;流速:0.3 mL/min;乙腈梯度洗脱。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件、检出限和定量性

分别进行对 BPA和 BPF环氧衍生物的分析。BPA环氧衍生物在 15 min内从水/乙腈 (55/45,V/V)上升至水 /乙腈 (35/65,V/V),BPF环氧衍生物则在 32 min内从水 /乙腈 (52/48,V/V)上升至水 /乙腈 (22/78,V/V)。同时在 2.3～230μg/L的质量浓度范围内具有良好的线性相关性,方法检出限在0.5660～6.5496μg/L之间。详细的色谱条件、检出限和定量性分析,参照研究得到的试验条件进行[10]。标准溶液色谱图见图 1,可知分析物在所用的色谱条件下得到很好分离,且分离时间短。

图 1 高效液相色谱法测定 BPA环氧衍生物标准溶液 (上)、食品罐头空白样品中BPA环氧衍生物(下)

2.2 方法的优化

2.2.1 传统皂化提取、超声波提取与微波辅助萃取法的对比

采用正己烷提取分析物,乙腈萃取正己烷层的方法比较了传统皂化提取、超声波提取与微波辅助萃取法。准确称取样品 2 g用 3种方法进行提取,各重复 3次,结果见图 2。

图 2 采用传统皂化提取法、超声波提取与微波辅助萃取法得到分析物提取数据(n=3)

由图 2可知,传统皂化提取法的提取率与超声波提取的结果基本接近,而微波辅助萃取法所得结果则高于前 2种方法。原因可能是与传统的皂化提取法相比,微波萃波主要利用微波对萃取溶剂及物料的加热作用,能够穿透萃取溶剂和物料使整个系统更均匀地加热。同时,微波会促使分子碰撞能量产生,加快化学作用,但不会破坏分子结构,因此萃取的选择性较高[11]。从试验结果看,BADGE·HCl的超声提取结果明显高于其他两种方法,可能是提取过程中超声作用破坏了某些 BADGE二基氯代化合物 (如 BADGE·2HCl,BADGE·HCl·H2O等)的分子结构。因此选定微波辅助萃取法作为前处理方法。

静置时间对提取结果有一定影响。采用 1.2.2方法处理 6组加标样品 (BADGE、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O、BADGE·HCl·H2O、BFDGE、3R-NOGE、4R-NOGE、5R-NOGE、6RNOGE分别为 1.1、0.32、1.0、0.46、1.0、0.99、0.9、0.94、1.0和 1.0 mg/L),静置时间分别为 10、15、20、25、30和 35 min。结果表明,静置时间为 30 min(RSD%:3.81%)和 35 min(RSD%:2.98%)时样品回收率均超过 96.47%。与较短静置时间相比,分析物受杂质干扰较少。因此,选择 30 min作为样品处理的静置时间。

2.2.2 提取试验的回收率

对空白样品取 3个质量浓度水平进行添加回收试验,分别加入不同量的标准溶液,按 1.2.2方法处理样品,进样试验,每个质量浓度重复试验 3次,结果见表 1。10种BPA和BPF环氧衍生物回收率均在86.97%～103.44%之间。

表 1 微波辅助萃取法提取试验的平均回收率(n=3)

2.2.3 SPE净化

BPA和BPF环氧衍生物的极性强弱有一些差别,所以选择最适合的洗脱液对标准物质的分析至关重要。在对固相萃取柱活化和平衡后,分别向各自的柱子 (标号为 SPE-1到 SPE-5)加入质量浓度为 1 000μg/L的 10种标准物质混合液。4 mL水 /甲醇(80/20,V/V)淋洗后,使用不同的溶剂对柱子进行洗脱。表 2是 PPL固相萃取柱经甲醇活化后各种洗涤液的平均回收率情况。

表 2 PPL(甲醇活化)经不同溶剂处理后的平均回收率(n=3)

从表 2可以看出,采用 4 mL甲醇作为活化溶剂,洗脱液为二氯甲烷、MTBE和乙腈时 BPA环氧衍生物和 BFDGE的回收率较为理想,均在 75%～105%之间,而另外 3种洗脱液得到的回收率则相对较差。

3～6R-NOGE的回收率结果表明,5种洗脱液对 PPL固相萃取柱的洗脱效果有明显差异。除乙腈外,4种洗脱液得到的回收率均低于 55%,而乙腈所得到的结果在 73.26%～77.88%之间。其原因可能是苯乙烯 -二乙烯苯 (SDVB)聚合物填料对 10种分析物有较强的吸附性,尤其是 3～6R-NOGE化学物。当采用强极性溶剂如乙腈作为洗脱液时,分析物才更易被洗脱下来。从表 4中也能发现,随着苯环的增加,回收率呈递减趋势。

试验中也曾选用 OASIS HLB固相柱,虽然 BPA环氧衍生物和 BFDGE的回收率均在 95%以上,但溶剂对 3～6R-NOGE的洗脱率却非常的低。因此,考虑到去除杂质和回收率两方面结果,选定乙腈作为PPL柱的洗脱剂。

2.3 精密度

取含有 BADGE、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·H2O、BADGE·HCl·H2O、BFDGE、3RNOGE、4R-NOGE、5R-NOGE、6R-NOGE的标准品日内日间分别重复进样 7份,计算 RSD值。结果表明该方法的日间和日内精密度分别在 2.28%～6.95%和 1.79%～7.71%之间。

2.4 罐头食品分析

采用 1.2.3的方法处理样品,通过液相色谱 -荧光检测的方法分析,测得一系列样品含量见表 3。

表 3 罐头食品中 BPA和 BPF环氧衍生物含量

由表 3可见,8种罐头食品中 BPA环氧衍生物的含量均有检出。虽然样品均未超过现行欧盟规定的检出限量 ,但 BADGE、BADGE·HCl、BADGE·2HCl、BADGE·HCl·H2O和 BFDGE检出率较高,分别达到 87.50%、62.50%、50.00%、62.5%和100%。这表明单基取代的部分 BADGE相关化合物可能在食品基质中通过水解形成了更为稳定的二元取代化合物[12]。NOGE的检测结果发现 10种罐头食品中有 3～6R-NOGE的残留。其中,7号和 8号食品的 NOGE总量达到 0.24 mg/kg和 0.46 mg/kg超出欧盟规定的 NOGE检出限量 (0.2 mg/kg)。

虽然市售大部分的罐头食品中 BPA和 BPF环氧衍生物含量都在法定限量内,但由于法定的检出限量相对较高,出于对公众安全的考虑,同时为了应对发达国家对进口商品的技术壁垒,我国应尽快采取措施制订更为完善、更为严格的食品法规,同时加大对罐头内涂料的开发,最大限度地减少包装材料对食品安全性的危害。

3 结论

通过对罐头食品采取微波辅助萃取,PPL固相萃取净化的方法提取双酚 A和双酚 F环氧衍生物,并应用高效液相色谱—荧光检测法分析,建立了食品中双酚A和双酚 F环氧衍生物含量的检测方法。在2.3～230μg/L的质量浓度范围内具有良好的线性相关系,方法检出限在 0.566 0～6.549 6μg/L之间;在 45～450μg/L添加水平范围内,微波辅助萃取法提取实验的平均添加回收率在 86.97%～103.44%之间;经 PPL固相萃取柱净化后的平均添加回收率为在 73.26%～104.98%,相对标准差均小于8.03%,证明该方法具有灵敏度高、检出限低和稳定性好的特点,适合罐头食品中 BPA和 BPF环氧衍生物残留分析。

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Analysis of ResidualBisphenolA,Bisphenol F and their EpoxyDerivatives in Canned Food by HPLC

XueMing Zhang Hong
(College of Food Science and Biotechnology Engineering,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310035)

A method was developed for deter mining residual bisphenolA(BPA),bisphenol F(BPF)and their epoxy derivatives in canned food by high-performance liquid chromatography(HPLC)with a fluorescence detector.Sampleswere extracted by microwave extraction and purified usingBond Elut PPL SPE(SDVB).Results:The mi2 crowave extraction presents satisfied effect.Bond Elut PPL SPE gives acceptable recoveries of 73.26%～104.98%and evident impurity removal.The microwave extraction and Bond Elut PPL SPE were applied to analyze some food samples.Results show thismethod is suitable for analyzing residualBPA,BPF and their epoxy derivatives in food.

high perfor mance liquid chromatography,Bisphenol A,Bisphenol F and their epoxy derivatives,residual deter mination,canned food

O622.6

A

1003-0174(2010)02-0136-05

2009-03-13

薛鸣,女,1985年出生,硕士,食品科学

张虹,女,1962年出生,教授,食品质量与安全、功能性食品、水产品开发