三种测定蛋白质热稳定性方法的比较

周翠燕，俞敏达，李文奇

(1.清华大学 生命科学与医学研究院，北京 100084; 2.国家蛋白质科学研究(北京)设施清华基地，北京 100084; 3.清华大学 生命科学学院， 北京 100084； 4.清华大学 结构生物学高精尖创新中心，北京 100084; 5.北京市第四中学国际校区，北京 100032)

蛋白质在加热过程中会发生热变性解折叠，蛋白质的热变性中点温度(melting temperature，Tm)是指在蛋白质解折叠50%时对应的温度[1].蛋白质的热变性过程与其空间构象的改变密切相关，Tm值能反映变温过程中蛋白质构象改变的趋势，是衡量蛋白质热稳定性的一个重要指标[2].蛋白质Tm值的测定在生物医药行业具有广泛的应用，如嗜热蛋白、工业酶等的改造与筛选[3]，蛋白质药物与配体、制剂或辅料的相互作用，蛋白质药物的缓冲液稳定条件筛选等[4].目前，常用的蛋白质Tm值的测定方法有差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)、圆二色光谱法(circular dichroism，CD)和差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry，DSF)等.

差示扫描量热法的应用始于20世纪60年代，是在程序控温下，通过测量输给待测物和参比物的功率差与温度的关系，以获得吸放热量的技术[5].差示扫描量热法能定量测量热力学参数，可提供与蛋白质热变性过程中构象变化有关的热效应信息[4, 6-7].圆二色谱法同样诞生于20世纪60年代，其原理是利用左、右两束偏振光透过具有手性结构的生物大分子等活性介质，获得的圆二色谱来分析其结构特点，是蛋白质、核酸、糖类等生物大分子二级结构分析的常规手段之一[8].变温过程中测量蛋白等物质的圆二色谱，能反映其随温度升高结构变化的趋势，所以圆二色谱法也是测定蛋白质Tm值的有效方法[9].差示扫描荧光法(也被称作ThermoFluor)出现于2001年，Pantoliano等[10]最先应用此技术测定了上百种蛋白质的热稳定性.差示扫描荧光法分为添加外源荧光染料与不添加荧光染料两种方式，都是利用加热使蛋白内部疏水基团暴露这一特点进行检测.前者通过添加与蛋白疏水部分亲和而产生荧光信号的染料，追踪记录变温过程中荧光信号的变化曲线来测定Tm值，后者则是通过检测蛋白去折叠过程中带有荧光生色基团的芳香族氨基酸(色氨酸和酪氨酸)所处疏水环境的变化来检测Tm值.

为了比较这三种广泛应用的蛋白质Tm值测定方法的检测特点和检测效果，本文选择了5种具有不同结构特点的蛋白质进行分析.单结构域单体的arabidopsis pyrabactin resistant like 10(PYL 10)、单结构域同源二聚体的arabidopsis pyrabactin resistant like 2(PYL 2)、多结构域单体的protein disulfide isomerase(PDI)、多结构域单体的Middle East respiratory syndrome 27(MERS-27)及多结构域多种聚集状态的bovine serum albumin(BSA)，其分子量、二级结构和高级结构特点等信息如表1(按分子量大小排序)所列.试验结果发现，三种方法所测的5类蛋白的Tm值整体上较为一致，但也存在一定差异.而结构更复杂的蛋白，并不一定有更多个Tm值.

表1 蛋白质样品信息汇总

1 试验部分

1.1 仪器

差示扫描量热仪，马尔文公司，型号为MicroCal Manual Vp-cap DSC(VP-DSC)；圆二色光谱仪，英国应用光物理(Applied Photophysics Ltd)，型号为Chirascan plus；差示扫描荧设备，Nanotemper公司，型号为Prometheus NT.48.

1.2 菌株与质粒

SnRK2.6、PYL 10基因由清华大学颜宁实验室惠赠，PDI基因由中国科学院生物物理所王志珍实验室惠赠，MERS-27基因由王新泉实验室惠赠，BSA购买自北京索莱宝科技有限公司，大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞由本实验室制备，HEK293F细胞由本实验室培养.

1.3 酶与生化试剂

质粒小提试剂盒购自天根生物科技有限公司，蛋白质分子质量标准marker为本实验室制备；用于制备缓冲剂的Tris，NaCl，HEPES购自国药集团化学试剂有限公司，纯度均大于99%；Ni-NTA镍柱柱材购自Qiagen公司；Sources Q、Superdex 200、protein A色谱柱购自Cytiva公司.

1.4 蛋白质表达

将表达质粒pet15D-PYL 10、pet15D-PYL 2、pet15D-PDI转化至BL21感受态细胞，涂板过夜培养，挑菌点接种至100 mL氨苄抗性LB培养基中, 37 ℃、220 r/min培养3～4 h, 以1∶100的比例将菌液转接至1 L氨苄抗性LB培养基中, 培养3～4 h至OD600(即600 nm时的光密度值)约为0.8～1时降温至18 ℃，平衡1 h后加入0.2 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达过夜，收菌体用于后续蛋白的纯化.

MERS-27使用293F细胞表达，将轻链、重链质粒、线性聚乙烯亚胺(PEI)按质量比1∶1.2∶2混合于293培养基中孵育30 min，转染生长期对数期的293F(按1 L细胞约加入1 mg质粒比例加入)，培养约48 h离心收取上清纯化抗体.

1.5 亲和层析、离子交换层析与分子排阻层析

PYL 10、PYL 2、PDI使用Ni-NTA亲和挂柱，250 mmol/L咪唑洗脱.抗体MERS-27使用protein A亲和挂柱，1 mol/L pH为2.7甘氨酸洗脱后过分子筛.

PYL 10、PYL 2、PDI使用阴离子交换柱Sources Q进一步分离纯化，使用缓冲液buffer A(250 mmol/L Tris pH为8.5)稀释蛋白样品约3倍体积后上Sources Q柱，以缓冲buffer B(250 mmol/L Tris pH为8.5, 1 mol/L NaCl)进行5%～50%体积比梯度洗脱，收取纯度较高的部分进行浓缩过分子筛.

将Superdex 200层析柱用pH为7.2，10 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl缓冲液平衡，分别纯化PYL 10、PYL 2、PDI、MERS-27、BSA(干粉溶解至1 mg/mL过柱)，收取纯度较高部分测定其浓度.

1.6 Bradford法蛋白质定量

取1 mL 1倍关系的考马斯亮蓝G-250稀释液于1.5 mL离心管中, 根据蛋白质溶液的浓度加入1～20 μL蛋白质溶液并混合均匀，使用分光光度计测量595 nm吸收值，根据事先制作标准曲线计算蛋白浓度，并将蛋白浓度调整至0.5～0.7 mg/mL用于后续Tm值测定.

1.7 三种Tm值测量方法参数设置与试验操作

三种方法的变温范围均为20～95 ℃，变温速率均为1 ℃/min.缓冲液条件均为10 mmol/L HEPES pH为7.2、150 mmol/L NaCl，样品质量浓度均在0.5～0.7 mg/mL.三种Tm测量方法的样品用量与试验时长信息如表2所列.

表2 三种测量方法的样品用量与试验时长比较

1.7.1 差示扫描量热法

首先在样品池中加入缓冲液重复4次变温程序以获得较准确的基线，再分别测定不同样品获得变温曲线.

1.7.2 圆二色光谱法

单点变温法：每个样品先进行190～280 nm的波谱扫描，确定其CD信号最高或最低的波长(即变温实验中变化最显著的波长)，在该波长下进行变温扫描实时检测(主要分布在210～220 nm).

多点变温法：抗体样品检测中使用了多点变温法，变温扫描过程中检测整个205～250 nm波段的变化.单点变温数据数据采用sigmoid或者double sigmoid模型拟合，选取最优模型拟合结果，多点变温数据使用global 3软件分析.

1.7.3 差示扫描荧光法

利用毛细管吸取蛋白样品约10 μL，5个蛋白样品同时进行变温扫描检测.

2 结果与讨论

2.1 蛋白质的表达与纯化结果分析

蛋白PYL 2、PYL 10、PDI由原核表达系统表达，使用Ni-NTA亲和纯化，洗脱的蛋白经阴离子交换柱Sources Q进一步纯化.抗体MERS-27由293F细胞分泌表达，过protein A亲和纯化.5种蛋白最终经分子筛Superdex 200纯化后置换到相同的buffer条件中，纯化结果dodecyl sulfate, sodium salt(SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)如图1所示.由图1可见，分子量大小与预期一致，5种蛋白纯度很高，均达到95%以上，调整其质量浓度至0.5～0.7 mg/mL用于下一步测试分析.

图1 蛋白纯化的SDS-PAGE分析

2.2 差示扫描量热法测定结果

差示扫描量热法测定5个蛋白质的变温扫描曲线如图2所示.由图2可见，5种蛋白的Tm值分布在40～80 ℃之间，其中PYL 2图谱是尖锐的单峰，而PYL 10、PDI、BSA及MERS-27图谱则呈现峰高与峰宽均有所差异的双峰，反映了5种蛋白质在升温热变性过程具有不同的解折叠特点.

图2 DSC变温扫描曲线

2.3 圆二色谱法对蛋白Tm值的测定结果

圆二色谱法测定5个蛋白的变温扫描曲线如图3所示.由图3可见，PYL 2的变温曲线在50 ℃左右时，斜率变化很大.PDI的曲线分别在30～60、60～70 ℃区间时，出现两个不同曲线斜率.而PYL 10与BSA曲线斜率变化均没有PYL 2大，MERS-27在65～75 ℃区间的曲线由下降陡变为上升而后又下降，推测是因为抗体受热从而析出沉淀.而析出的沉淀则影响了CD光谱的检测，因而出现信号异常.

图3 CD变温扫描曲线

2.4 差示扫描荧光法对蛋白Tm值的测定结果

使用差示扫描荧光法测定5种蛋白质样品，试验得到的变温扫描曲线如图4所示.由图4可见，对350/330 nm曲线(1)进行一阶求导，可以得到对应的峰图(2).一阶导曲线可以直观地反映受热过程中蛋白结构的变化情况，峰尖或波谷对应蛋白的Tm值.

图4 DSF变温扫描曲线

2.5 三种方法测定蛋白Tm值的结果对比

差示扫描量热法、圆二色谱法、差示扫描荧光法测定5种蛋白质的Tm值的结果如表3所列.

表3 差示扫描量热法、圆二色谱法、差示扫描荧光法对蛋白Tm值的测定结果统计及差异比较

使用三种测定方法对5种不同蛋白质的Tm值进行测量，每种方法重复三次，选取其中一次变温曲线展示在结果中(图2～4).样品用量及所用时长见1.6节，可以看出样品用量：差示扫描量热法>圆二色谱法>差示扫描荧光法，测定的总用时长：差示扫描量热法>圆二色谱法>差示扫描荧光.此外，软、硬件操作及后期数据处理的便捷性：差示扫描荧光>差示扫描量热法>圆二色谱法.三种方法测量蛋白样品的Tm值高低均为MERS-27>BSA>PYL 10>=PDI>PYL 2，反应的趋势较为一致.

MERS-27的Tm值测定中，圆二色谱法曲线在65 ℃至75 ℃区间有信号异常[图3(e)]，这是因为抗体受热而沉淀析出影响了CD光谱的检测.降低抗体浓度，采用多点变温法测定获得的数据表明抗体至少有一个确定的Tm值点71.5 ℃.在BSA的Tm值测定中，差示扫描量热法图谱显示在78 ℃测得信号很低的峰，但圆二色谱法和差示扫描荧光法则没有在该温度点检测到信号.

通过对三种检测方法均检测出的Tm值进行单因素方差分析，发现三种检测方法对PYL 10的Tm值检测结果一致.圆二色谱法未测出MERS-27的Tm1，但测出的Tm2与其他两种检测方法结果一致.三种方法对PYL 2及PDI的检测结果不一致，其中PYL 2的差示扫描量热法与差示扫描荧光法检测结果有一定的差异.PDI的三种检测方法对其Tm1的检测结果差异较为显著.

3 结论

本文通过比较三种广泛使用的蛋白质Tm值测定方法分析5种不同特点的蛋白质发现，虽然检测原理各不相同，但不同方法测定的Tm值结果总体一致或相近，除PDI的Tm1外，其余结果均相差2 ℃以内.同为光谱学方法的圆二色谱法和差示扫描荧光法检测结果具有更高的一致性.需要指出的是在检测抗体MERS-27时，检测过程中观察到絮状沉淀析出，推测是该沉淀干扰CD信号检测而不能确定Tm1，这说明MERS-27抗体的Tm值虽高，但是受热不稳定，容易产生聚集.表明圆二色谱法不适合受热易沉淀的蛋白质的Tm值检测，但是也可以利用这一特点作为抗体药物等快速鉴定聚集产生的方法[16].

此外，图谱中峰宽窄或曲线陡缓能够在一定程度上反映结构受热变化的快慢.例如，三种方法对PYL 2的Tm值测定中，尖锐的峰型(DSC、DSF)或是陡变的曲线(CD)都表明这是一个比较快的变化过程.

已知研究结果显示，抗体类蛋白在热变性时具有不同热稳定性的各结构域会先后去折叠，因而会检测到多个Tm值[17-18].本文对比了蛋白Tm数量与蛋白结构域及聚集形态的关系，PYL 2和PYL 10具有单结构域，而PDI、BSA及MERS-27都具有多结构域，而PYL 10，PDI，MERS-27在溶液中都是以单体形式存在， BSA具有多种聚合状态，PYL 2则以二聚体形式存在[11-15].本文研究结果表明，结构更复杂的蛋白，并不一定具有更多个Tm值.

比较三种方法实际操作的特点发现，DSF法在样品用量及测定效率上更有优势，比较适合进行高通量筛选.但该方法需要样品含有色氨酸、酪氨酸或额外添加荧光染料，这可能会对样品测量范围带来一定限制.DSC法虽然在样品用量与检测效率上不及DSF，但作为量热的经典方法仍是不可缺少的Tm值测量手段，在进行批量样品的热稳定性筛选时，联合使用DSF法初筛，DSC法复筛是十分有效的组合方式.此外，DSC 能测定蛋白质变性过程中的热容变化ΔCp、焓变 ΔH、解折叠自由能ΔG、玻璃态转变温度、分子流动临界温度等其他重要热力学参数.CD作为检测蛋白二级结构的经典方法，在Tm值测定方面具有其独特优势和一定的局限性，也是研究加热过程中蛋白结构改变的重要方法[9].

蛋白质Tm值测定具有重要的实际应用价值，例如辅助生物药物开发、生产和质量控制，评估生物相似性、优化蛋白药物配方等，还可以作为探索蛋白质高级结构的手段之一指导蛋白质工程，如比较不同突变对蛋白质稳定性的影响[19-20]，研究结构域改变与功能活性改变关联性等.比较不同Tm值测定方法，全面了解技术特点及测量效果对于Tm值测定的实际应用具有一定的指导意义，在科研或生产工作中可以灵活选用或联用多种技术来阐明不同条件下的结构变化特点.