高效液相色谱法测定毛樱桃中维生素C含量

徐雅倩，郑龙华，杨帆，姜雨婷，曹玉珍，田超，张晓燕

(通化师范学院 食品科学与工程学院，吉林 通化 134000)

毛樱桃[学名：Cerasus tomentosa(Thunb.)Wall]，俗称山樱桃，蔷薇科，樱属，落叶灌木[1-2],主要生长在北半球温带地区，吉林省长白山区有大量分布[3].毛樱桃富含蛋白质、碳水化合物、微量元素以及多种维生素，研究表明毛樱桃不仅具有食用价值，还有多种保健或药用功效[4-6].毛樱桃中维生素C含量比较丰富，但对其含量检测的报道较少，并且开发利用的研究也不多见.维生素C主要包括还原型的L-抗坏血酸(L-Vc)和氧化型的D-异抗坏血酸(D-Vc)，两者在人体内均不能自动合成，主要从日常的蔬菜、水果等膳食中获取[7-8].L-抗坏血酸可以作为食品添加剂，应用于食品工业中，例如用于防止食品腐败变质.D-异抗坏血酸的生理活性极低，仅为L-抗坏血酸的0.05[9-10].

目前，使用高效液相色谱法测定不同构型的抗坏血酸的研究已经取得了一定进展，文献[11]报道的方法解决了样品前处理复杂、被测物性质不稳定、分离度低的问题.张晓燕等[8]借助高效液相色谱仪缩短样品分析时间，在短时间内更准确地进行维生素C含量的测定.文献报道中多数都是对L-抗坏血酸进行检测.本研究使用高效液相色谱法对毛樱桃中的L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸的两种成分进行检测，研究了毛樱桃中维生素C的总量.该方法提取过程严格避光、热，避免了氧化问题.研究结果为毛樱桃的食用、药用价值及未来的开发利用提供一定的参考.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(LC-20AT型)，日本岛津有限公司；紫外检测器(LC-20A型)，日本岛津有限公司；色谱柱(Inert Sμstain C18, 5 μm, 4.6×250 mm)，广州步步宏科学仪器设备有限公司；电子天平(AL104型、感量0.1 mg)，上海亚津电子科技有限公司；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9101-3S 型)，上海三发科学仪器有限公司；电子天平(YP1002、感量0.01 mg)，上海恒平有限公司；超声波清洗器(KQ-100E 型)，昆山市超声仪器有限公司.

偏磷酸、磷酸(分析纯)，天津市致远化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)，天津市致远化学试剂有限公司；L-抗坏血酸标准品(纯度≥99%，产品编号：C10059331)，上海麦克林生化科技有限公司；D-异抗坏血酸标准品(纯度≥98%，产品编号：Y30D6C8306)，江苏绿叶生物科技有限公司；试验用水均为市售娃哈哈水(pH为5.0～7.0，电导率不大于10 μS/cm).毛樱桃样品：采摘于吉林省长白山区通化师范学院校园周边.

1.2 样品溶液的提取

维生素C的稳定性较差，在pH值大于或等于7的条件下易被氧化.为保证维生素C的稳定性，减少其含量的损失，应在其pH值低于7的条件下进行提取[12-13].

将除去果核的山樱桃果肉精确称取3 g，在避光条件下，放入研钵中加入10 mL 20 g/L的偏磷酸溶液进行充分研磨提取，将样品溶液全部转移至50 mL棕色容量瓶，使用20 g/L的偏磷酸溶液稀释定容，摇匀，先使用滤纸进行过滤，滤液再用0.45 μm滤膜进行过滤，做好标记，立即上机测定.

1.3 标准曲线绘制

精密称取L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸标准品各10 mg至10 mL容量瓶中，使用20 g/L偏磷酸溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1 mg/mL的标准品溶液.分别吸取不同体积的标准品溶液，使用偏磷酸溶液依次稀释成质量浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、10.00、50.00 μg/mL的L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸混合标准溶液，选用0.45 μm微孔滤膜过滤，待测.

1.4 色谱条件

检测波长的选择：将标准品溶液注入液相色谱仪进行检测波长扫描，在200～400 nm范围内扫描，根据紫外吸收情况确定检测波长为245 nm.

流动相比例的筛选：国家标准中选用的流动相比较复杂，本课题对流动相进行调整，选用0.05 mol/L磷酸溶液∶甲醇作为流动相，体积比选择了5种比例进行检测，分别为90∶10、93∶7、95∶5、96∶4、98∶2.根据色谱峰分离度、保留时间等进行对比分析，最终选择体积比98∶2为最佳比例.

流速的筛选：本文更换了流动相种类，所以选用0.90、0.80、0.70 mL/min这3种流速进行检测，根据色谱峰分离度及保留时间，确定最佳流速为0.70 mL/min.

柱温的筛选：根据参考文献[13]，并结合试验期间实验室具体温度，柱温选择25 ℃.

2 结果与讨论

2.1 仪器精密度

精密吸取L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸混合标准溶液(5 μg/mL)20 μL，在筛选的色谱条件下进行检测，连续测定6次.使用6次测定结果的峰面积值计算相对标准偏差，结果如表1所列.由表1可知L-抗坏血酸的相对标准偏差为0.6%，D-异抗坏血酸的相对标准偏差为0.6%，结果表明该仪器精密度较好，完全满足检测需要.

表1 L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸精密度测定结果(n=6)

2.2 定性分析

在1.4色谱条件下，精密吸取流动相、标准品混合溶液(10 μg/mL)、毛樱桃样品溶液各20 μL注入液相色谱仪进行检测，结果如图1所示.由图1(b)可知，L-抗坏血酸标准品的保留时间为7.299 min，D-异抗坏血酸标准品的保留时间为7.742 min，分离度为1.50.由图1(c)可知，毛樱桃样品溶液色谱峰保留时间为7.282 min，流动相在该时间段内没有色谱峰，可以确定样品溶液中检出L-抗坏血酸，未检测出D-异抗坏血酸.

图1 流动相、抗坏血酸标准品及毛樱桃样品色谱图

2.3 标准曲线绘制

精密吸取20 μL、不同浓度的抗坏血酸混合标准品溶液注入液相色谱仪.以标准品质量浓度(μg/mL)为横坐标x，色谱峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线，结果如图2所示.由图2可知，L-抗坏血酸线性回归方程：y=103 824.84x-7 302.52，相关系数r为1.0.D-异抗坏血酸线性回归方程：y=107 724.19x-3 931.70，相关系数r为1.0.根据上机分析结果可知：L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸两者在0.05～50.00 μg/mL范围内线性关系良好，满足定量分析需要.

图2 L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸标准曲线图

2.4 样品L-抗坏血酸含量测定

精密吸取毛樱桃样品溶液20 μL，注入液相色谱仪进行分析.分析得到的色谱峰面积结果带入标准曲线，可得L-抗坏血酸的质量浓度为4.945 μg/mL.再根据取样量，计算出毛樱桃中L-抗坏血酸的含量为8.24 mg/100 g.

2.5 L-抗坏血酸含量重复性试验

称取6份毛樱桃样品进行平行试验，按照1.2方法提取，并且按照1.4色谱条件进行检测，检测结果带入标准曲线，根据外标法计算毛樱桃中L-抗坏血酸的含量，结果如表2所列.由表2可知，6次重复试验测得毛樱桃中L-抗坏血酸的含量的相对标准偏差(RSD)为1.3%，表明本试验方法的重复性较好.

表2 L-抗坏血酸的含量重复性测定结果

2.6 稳定性试验

采用新配制的L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸标准品溶液(10 μg/mL)考察两种成分溶液的稳定性.将配好的标准品溶液每隔4 h进行一次检测，进样量为20 μL，计算标准品溶液在24 h内的相对平均标准偏差，考察其稳定性，结果如表3、4所列.

由表3可知，L-抗坏血酸在8 h时RSD为1.5%，在12 h时RSD为1.6%.即L-抗坏血酸在8 h之内稳定，8 h以外样品溶液峰面积逐渐减小，样品中L-抗坏血酸发生改变.因此在进行L-抗坏血酸含量检测时应在8 h之内尽快检测完毕，避免由于其发生变化而引起计算结果偏差.

表3 L-抗坏血酸稳定性试验结果

由表4可知，D-异抗坏血酸在4 h时RSD为1.6%，说明D-异抗坏血酸稳定性较差.进行D-异抗坏血酸含量检测时应立即进行检测，避免由于其发生变化而引起计算结果偏差.

表4 D-异抗坏血酸稳定性试验结果

2.7 加标回收试验

根据L-抗坏血酸含量测定结果(8.24 mg/100 g)，分别称取质量相近的样品3份，每份样品中分别加入100.00、250.00、500.00 μg的L-抗坏血酸标准品.再另外称取3份样品加入D-异抗坏血酸标准品，按照1.2样品提取处理方法进行处理，在1.4色谱条件下进行检测,结果如表5所列.由表5可知，L-抗坏血酸的平均加标回收率为90.83%～92.52%，相对标准偏差为0.9%.D-异抗坏血酸的平均加标回收率为91.93%～92.99%，相对标准偏差为0.7%，表明此方法结果良好.

表5 L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸加标回收率试验

3 结论

本文采用高效液相色谱法同时测定山樱桃中L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的含量，方法方便快捷，准确度好、灵敏性高、回收率好.检测出毛樱桃中L-抗坏血酸含量为8.24 mg/100 g，未检出D-异抗坏血酸.此方法样品前处理简单，可减少毛樱桃中不同构型抗坏血酸含量的损失.试验的测定结果表明毛樱桃中L-抗坏血酸的含量较高，D-异抗坏血酸未测定出，此研究结果可为毛樱桃的L-抗坏血酸的开发利用及其他研究提供一定的参考.