三维石墨烯金属网固相萃取测定有机磷农药残留

朱 风，丁 荣，徐 浩，杨庆利，吴 薇，侯秀丹

(青岛农业大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266109)

农药残留一直是食品安全领域关注的重要方面之一.目前，由于农药残留污染食品引起的食物中毒人数已占食物中毒总人数的三分之一，其中有机磷农药是第一位.有机磷农药主要用于预防植物病害、昆虫和杂草，过量使用容易残留在食物或环境样品上.残留的农药侵入人体会引起头痛、烦躁不安和呼吸困难症状[1]，长期食用被污染的食品会导致癌症甚至死亡[2-3].中国和其他国家规定了大多数有机磷农药的最大残留限量不应超过0.2 mg/kg或0.5 mg/kg[4].因此，食品中有机磷农药的精准检测和监测对保证食品安全至关重要.

由于食品基质的复杂性、成分的多样性和痕量的残留物，直接使用仪器检测有机磷农药非常困难.通常，选择使用合适的样品前处理方法对其进行分离和富集，可以提高检测的灵敏度和准确性.传统的液液萃取和固相萃取均存在有机溶剂消耗多且耗时的缺点.近年来，基于新型材料的萃取方法常用于有机磷农药的检测，比如分散液-液微萃取[5]、分散固相萃取[6]、中空纤维液相微萃取、磁固相萃取[7]、超声辅助乳化和液相微萃取[8]等.这些萃取方法缩短了萃取时间，减少了有机溶剂消耗.目前研究的新型材料主要集中在金属有机骨架材料[9-10]、共价有机骨架材料[11]、离子液体[12-14]、分子印迹聚合物[15]和碳材料[16-18]等.

基于金属网的吸附微萃取是一种新的萃取方法，已广泛使用[19].大量的吸附材料可以被涂覆到金属网的表面上，与分析物的接触面积大大增加，并且萃取平衡相对较快，缩短了萃取时间.

石墨烯气凝胶作为一种三维材料，自2013年问世以来，由于其超大的比表面积、出色的机械性能、高孔隙率和低密度而受到了越来越多的关注[20-23].在样品前处理领域，被设计并制备成多孔且具有两亲性的吸附剂来吸附、萃取和预富集污染物[24-25].尽管石墨烯气凝胶的三维框架结构可以提供大量的吸附位点[25]，但其具有结构单一的缺点，导致对有机磷农药的吸附选择性差.因此，为了实现复杂食品中痕量有机磷农药的高效富集，有必要制备改性的石墨烯气凝胶以提高萃取性能.纳米材料具有较大的比表面积、特殊的电子结构和化学性质，Au纳米颗粒除具有其它纳米材料的一些优良的性质外，还具有一个特殊的性质[26]：带有-S-的分子可以更好地吸附在Au纳米颗粒的表面.

本工作将Au纳米颗粒改性的氧化石墨烯气凝胶修饰的金属网(Au/GOA-SSM)作为萃取材料，整合了吸附萃取和氧化石墨烯气凝胶吸附特性的优点.通过一系列的表征手段证明了该复合材料的成功合成，并优化了与萃取工艺有关的相关参数，最后将该方法用于蔬菜中4种不同有机磷农药的分析检测.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

SPE-80数控固相萃取仪(济南海能仪器股份有限公司)；高效液相色谱仪(UltiMate3000，赛默飞世尔科技)，配有DAD检测器和自动进样器；JSM-6701F扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；X射线光电子能谱仪(XPS，ESCALAB250Xi，美国).液相色谱使用C18色谱柱(HYpersil ODS2，250 mm × 4.6 mm × 5 μm)，流动相由不同比例的甲醇和水组成，梯度洗脱：0～12 min，73%甲醇；12～13 min，73～78%甲醇；柱温箱的温度为25 ℃；流动相的流速：1.0 mL/min；检测波长为230 nm.

不锈钢金属网(SUS304，孔74 μm，Φ50 μm)购自蕾蔻金属制品公司(中国常州).石墨粉、辛硫磷、双硫磷、倍硫磷、杀螟硫磷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺购自上海阿拉丁试剂公司.HAuCl4、柠檬酸三钠购自上海麦克林生物化学有限公司(中国上海).商业萃取柱(C18，Carb，SAX，Florisil，-NH2)和固相萃取空柱(3 mL)购自深圳生物通信生物技术有限公司(中国深圳).

1.2 试验方法

1.2.1 萃取材料的制备

氧化石墨烯(质量分数为0.1%)通过改良的Hummers方法制备得到[27].

Au纳米颗粒的制备：将20 mL HAuCl4水溶液(质量分数为0.01%)在搅拌下加热至沸腾，迅速加入0.4 mL柠檬酸三钠水溶液(质量分数为1%)，继续加热至溶液变为酒红色，反应15 min后停止加热，搅拌状态下自然冷却至室温，置于4 ℃下储存备用.

Au/GOA-SSM的制备过程如图1所示.首先，将不锈钢金属网剪成直径为8 mm圆形，浸入稀盐酸中进行刻蚀，干燥后，将其放入APTES中12 h以完成氨基的修饰.然后，将获得的金属网放入装有4 mL氧化石墨烯悬浮液，0.001 gN-羟基琥珀酰亚胺和0.001 gN-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺的5 mL离心管中，70 ℃下反应2 h，将其转移至冷冻干燥器(20 Pa，-50 ℃)中保持10 h，重复该过程3次以获得所需厚度的涂层.干燥后，将其放入5 mL离心管中，加入制备的金溶胶，反应2 h后停止，干燥后的Au/GOA-SSM置于室温下储存，备用.

图1 Au/GOA-SSM的制备过程

1.2.2 样品预处理和萃取过程

香菜购自当地的超市(中国青岛).首先，使用高速粉碎机将香菜粉碎，将1 g香菜粉放入10 mL乙醇/水(体积比为70∶30)混合溶液中，在55 ℃摇动萃取3 h.之后，将混合物离心除去香菜样品并保留萃取剂，然后将萃取剂使用氮气吹至2 mL，最后将其用超纯水定容至20 mL，以进行萃取.

萃取过程在自动固相萃取仪上进行.首先，将三片Au/GOA-SSM装填到3 mL固相萃取空柱中，柱子的两端通过两个筛板进行固定.填充的Au/GOA-SSM使用10 mL乙腈/水(体积比为1∶1)进行活化预处理.将质量浓度均为200 μg/L的4种有机磷农药的水溶液(20 mL)，以1.5 mL/min的流速进样到Au/GOA-SSM填充的固相萃取柱中，然后，使用0.5 mL水洗涤吸附剂，在空气中干燥5 min后，使用洗脱液(1 mL乙腈)以0.8 mL/min的流速洗脱保留在吸附剂上的有机磷农药.最后，将得到的洗脱液直接用高效液相色谱进行分析，三次重复测量以获得平均值作为最终数据.

2 结果与讨论

2.1 材料表征

Au/GOA-SSM的表面形貌通过扫描电镜在不同倍数下进行表征.由图2可见，金属网的骨架结构是由不锈钢丝相互连接而成，并被氧化石墨烯气凝胶所包裹，也可以明显看到石墨烯的片层结构和褶皱结构.通过X射线光电子能谱表征[图2(C)]，Au/GOA-SSM表面出现Au元素，表明其成功合成.

图2 (A, B) Au/GOA-SSM的扫描电镜图, (C) X射线光电子能谱图

2.2 理论相互作用能

基于密度泛函理论，使用Gaussian09软件对Au与4种有机磷农药分子之间的相互作用模型进行调整和作用位点优化，获得了最合适的理论相互作用能，结果如表1所列.在理论计算过程中，考虑了它们之间的氢键、配位作用等参数.由表1可见，具有P=O基团的杀螟硫磷与Au纳米粒子的结合能更高.

表 1 4种有机磷农药在金纳米颗粒上的理论作用能及油水分配系数(log KOW)

2.3 条件优化

本试验优化了萃取和洗脱条件，包括进样体积、进样速率、洗脱剂类型、洗脱剂体积等.在优化试验中，使用的有机磷农药标准溶液的质量浓度为200 μg/L.

2.3.1 萃取条件

试验选择了三片金属网填充于固相萃取小柱中.因为吸附剂的吸附量有限，所以本试验考察了不同的进样体积(10～60 mL)对回收率的影响，结果如图3所示.由图3(a)可见，当样品体积低于20 mL时，萃取回收率几乎保持不变，之后萃取回收率逐渐降低，表明在20 mL时达到动态平衡吸附.因此，20 mL为最佳进样体积.

进样速率从两方面影响萃取效率.较高的进样速率可以节省操作时间，但由于分析物与萃取材料之间的接触不足，易造成分析物流失.相反，较低的速率会导致在萃取材料和样品溶液之间出现分析物的“反萃取”现象.如图3(b)所示，随着进样速率的增加，4种有机磷农药分子的回收率先升高后降低，因此，选择1.0 mL/min作为样品的进样速率.

2.3.2 洗脱条件

选择合适的洗脱溶剂是提高萃取效率的最重要的方面，理想的洗脱剂可以将分析物从萃取材料表面完全洗脱下来.本工作研究了几种常用的有机溶剂，包括甲醇、丙酮、乙腈等.图3(c)显示乙腈的萃取效率最高，因此将乙腈用于有机磷农药的洗脱.

在洗脱过程中，当洗脱液流过萃取材料时，有必要探究最小的洗脱液体积，以保证分析物在完全解吸的条件下节省有机溶剂.如图3(d)所示，分别研究了0.5、1.0、1.5 mL洗脱液.结果表明，1.0 mL洗脱液可以充分洗脱分析物.因此，使用1.0 mL乙腈对分析物进行洗脱.

图3 萃取和洗脱条件的优化

2.4 萃取性能和萃取机制的研究

图4(a)显示了商用萃取材料(50 mg，SAX，C18，-NH2，Florisil，Carb)和制备的萃取材料(Au/GOA-SSM)对4种有机磷农药的萃取回收率比较结果.由图4(a)可以看出，与商用的萃取材料相比，Au/GOA-SSM呈现出明显优异的萃取性能.图4(b)对比了不同有机磷农药的油水分配系数、理论吸附能和萃取回收率.由图4(b)可见，其油水分配系数，即有机磷农药的亲疏水性对萃取回收率的影响较大.

图4 (a) 不同材料的萃取回收率比较, (b) 影响萃取性能的因素对比

2.5 方法学评估

在优化的试验条件下，对基于Au/GOA-SSM建立的固相萃取-高效液相色谱方法的分析性能进行评估，包括线性范围、检测限、重复性和重现性等，结果如表2所列.由表2可见，辛硫磷和杀螟硫磷在1～200 μg/L范围内、双硫磷和倍硫磷在0.5～200 μg/L范围内线性关系良好，相关系数在0.990 6～0.998 9之间，检测限均在0.2 μg/L以下，能满足我国和其他国家最大限量检测的要求.通过使用单根萃取柱从标准溶液中进行5次连续萃取来探究该方法的精度，相对标准偏差在2.8%～5.6%之间.通过使用相同方法制备的5根萃取柱对有机磷农药进行萃取来探究萃取柱的重现性和方法的准确度，相对标准偏差在5.9%～9.8%之间，可见建立的萃取方法对有机磷农药分子具有较高的萃取性能和良好的重复性.

表2 有机磷农药的线性范围、相关系数、检出限和相对标准偏差

2.6 实际样品的应用

为了探究所建立方法的实用性，将其应用于香菜样品中4种有机磷农药分子的测定，结果如表3所列、图5所示.由图5可见，在香菜样品中未检测到有机磷农药的存在.本试验进一步通过加标回收的方法，考察了样品中基质对所制备材料萃取性能的影响.在香菜样品中分别加入质量浓度为20、40、100 μg/L的有机磷农药标准溶液后进行测定，由结果得其回收率在70.4%～97.7%之间，相对标准偏差在3.9%～10.3%之间.

表3 香菜中有机磷农药的含量、加标回收率和相对标准偏差(n=3)

图5 实际样品以及加入20、40、100 μg/L标准溶液的色谱图

3 结论

本研究通过化学键合、冷冻干燥、化学还原等一系列方法制备得到三维Au/GOA-SSM萃取材料，并应用于蔬菜中有机磷农药分子的萃取和检测.金属网作为萃取基体，减少了氧化石墨烯的堆积，提高了Au纳米颗粒的负载量.与商用的萃取材料相比，制备的此材料对有机磷农药的萃取回收率明显提高.该材料优异的萃取性能归因于氧化石墨烯气凝胶的吸附性能、Au对有机磷农药的选择性吸附以及金属网作为基体的通透性.建立的方法对有机磷农药呈现出较宽的线性范围和较低的检测限，具有简便、成本低和灵敏度高等优势.将其用于香菜中有机磷农药的检测，未检出.通过加标回收率的考察，其结果均在70.4%～97.7%之间，可见该方法具有良好的适用性.