利用CIRAS-3光合仪获取有效数据的探讨

宋雪皎，谷淑波，高居荣

(作物生物学国家重点实验室，山东农业大学农学院，山东 泰安 271018)

CIRAS-3光合仪是美国PP SYSTEMS公司生产的第三代光合测定系统，采用开放式气路系统和双气室红外线气体分析仪的原理，通过检测植物光合作用过程中CO2和H2O的变化量来测得植物叶片的光合速率、蒸腾速率和气孔导度等相关参数.与CIRAS-2型相比，该仪器在环境因子控制和光源控制等方面进行了全面升级，已被广泛应用于农学[1-2]、园艺[3]、林学[4]、植物生理[5-6]、植物生态[7]、植物病理[8]等相关研究领域.

由于CIRAS-3光合仪使用时，需要注意的事项较多，如果操作不当，则可能导致测定数据难以稳定或者偏差过大.为使初学者能够快速掌握光合仪的正确操作方法，做到正确使用并获取有效的光合数据，根据使用经验，对光合仪的测试原理、操作方法、注意事项、维护和保养、常见问题解决5个方面进行研究总结，以期为使用者提供有效的参考和帮助，切实提高CIRAS-3光合仪的使用效益.

1 CIRAS-3光合仪测定原理和测定参数

1.1 CIRAS-3光合仪测定原理

CIRAS-3光合仪测定原理如图1所示.从进气口通入流速稳定的空气，使未经同化室的空气作为参比气进入一个气室，从同化室出来的空气作为样本气进入另一个气室，由红外监测器检测出参比气和样本气的CO2和H2O浓度差，然后根据其浓度差、同化室中叶片面积和气体流量计算出光合速率.

图1 CIRAS-3光合仪工作原理

1.2 CIRAS-3光合仪测定参数

CIRAS-3光合仪测定参数有三种：一是直接测定参数，如净光合速率、蒸腾速率等.二是测定环境参数，包括参比室内CO2/H2O的浓度、环境相对湿度、叶片及叶室温度等，可通过测定环境参数来判断仪器工作状态是否正常.三是可计算参数，是通过光合响应曲线的测定而获得的数据，包括光补偿点、CO2补偿点、饱和光强等(如表1所列).

表1 CIRAS-3光合仪测定参数

2 CIRAS-3光合仪操作方法

2.1 启动程序

按下ON/OFF电源开关，蓝色LED指示灯亮，约30 s主机屏幕显示欢迎界面.点击Continue启动CIRAS-3程序，右下角百分数是剩余电量及使用时间，左下角温度是仪器预热直至达到红外分析室工作温度55.5 ℃.继续等待仪器进行自动调零(ZERO:30 s)和差分平衡校正(Diff Bal:25 s)，此时数字参数栏为“--”状态.仪器会在0、6、12、23、39和59 min时自动进行调零，此后每30 min自动调零一次.所以，使用时可以提前30 min开机，仪器进行预热自检，减少等待时间.

2.2 设定实验参数

CIRAS-3光合仪常用参数设置界面如图2所示.Configuration项选择形状、大小尺寸合适的叶室.Zero DiffBal Mode(调零和差分平衡)选择Automatic项.如果缓冲瓶供气，CO2Reference供气选择Ambient(remove chemicals)项，即自然环境(移除吸收剂).H2O Reference 湿度控制选择Fixed of reference项，100%表示不控制湿度，但夏天湿度较大，测定时可设置为60%.Cuvette Flow(叶室气体流速)项参数默认.Light Source选择LED光源，根据测定样品特性输入LED值.RGBW Control项设置Red为90，Green为0，Blue为5，White为5.Temperature Sensor Measurement项选择Energy Balance(能量平衡法).Temper Ature Control Type项选择Track cuvette to ambient(使叶室温度同环境温度).Leaf Area(叶面积)，Boundary Layer Resistance(边界层阻力)和Adaxial Stomata(气孔比率)三项参数默认.

图2 利用缓冲瓶供气常用参数设置界面

2.3 判断仪器测试状态

CIRAS-3光合仪完成自动调零和差分平衡后，可以利用Measured Data参数(图3左上角)来判断仪器测试状态是否正常.CO2r正常范围在380～420 μmol/mol，变化幅度为±0.1 μmol/mol且稳定.如果CO2r低于380 μmol/mol，说明分子筛失效需要更换.CO2r高于420 μmol/mol，说明缓冲瓶里CO2浓度过高，需人工换气.CO2d落差变动幅度为±1 μmol/mol，如CO2d值高于1 μmol/mol，说明叶室漏气需检修.一般要求环境相对湿度RH低于70%，如果RH高于70%，说明湿度过高需控湿，可将参数H2O Reference值调低，或者提示温度不正确，需检修叶室.湿度落差H2Od值变动幅度为±1 μmol/mol，如果H2Od高于1 μmol/mol，说明叶室漏气，需检修叶室.另外，查看参数PARi值是否达到设定值且稳定，Tamb、Tcuv、Tleaf等参数值是否正常且稳定.

图3 判断仪器测试状态程序界面

2.4 记录有效数据

利用Photosynthesis Data参数(图3右上角)判断实时实地测定的光合数据是否有效.叶室打开，夹进叶片(叶片处于自然状态)，打开主机，等待仪器反应稳定时间2～3 s，观察A值是否上下稳定波动，稳定波动时间能否持续半分钟.A值达到相对稳定后，再观察参数A、Ci、Gs、E值是否出现极限值.一般A值在0～40之间，Ci值在0～2 000之间，Gs值在0～2 000之间，E值在0～20之间.如果A值相对稳定，同时A、Ci、Gs、E值均无异常值后可以开始记录数据.

3 CIRAS-3光合仪使用注意事项

3.1 勿过量充电

光合仪每次充电6～8 h，指示灯变绿或主机屏幕电量显示100%即充电完成.一次充电时间不可超过12 h，过量充电会造成电池损坏，缩短电池储量及使用寿命.

3.2 及时更换吸收剂

吸收剂一般均含有指示剂，吸收H2O/CO2后变质会有颜色变化，易判断，需要及时更换.试验表明，如果变质后未更换，光合测定数据会偏低，甚至测定数据无效.

碱石灰吸附CO2后由白色变为浅紫色，不可重复利用，如有50%失效，需更换掉失效部分.干燥剂一般是硅胶干燥剂，吸收H2O后颜色由橘黄色变为黑褐色，可循环利用，如有50%失效，需更换掉失效部分.分子筛为白色球形颗粒，平时可放在棕色瓶中密封保存，长时间使用无明显颜色变化.仪器连续使用一周或放置一月以上，主机开机显示CO2r值小于360 μmol/mol时，需要更换分子筛.

3.3 正确连接PLC叶室

PLC叶室有气路和电信号两路接口.电信号接口注意方向性，箭头朝向12点方向凹槽处插入.电信号接口应在断电状态下插拔，插拔时需握住接头头部用力，勿直接拉拽后端线缆，以免电源线被扯坏，当插拔不顺畅时可均匀涂抹少许凡士林润滑.

3.4 须晴天测定光合

研究表明，光照、湿度、温度均会影响光合速率，野外测定光合最好在晴天，太阳光越强越好.一般阴雨天气、多云天气和长时间下雨突然放晴的天气尽量不要测定，因为湿度大时影响叶片气孔导度，导致光合数值稳定非常慢，效率特别低.同时，阴天时外界光强比较低，不能充分激活暗反应过程中卡尔文循环中相关酶的活性，测定的光合数据往往较低.

3.5 最好上午测定光合

光合测定最好在上午，太阳出来2 h后进行，但测定光合作用日变化曲线时除外.冬天可在上午9点左右开始，夏天可在上午7点左右开始.中午12点之后不适合测定光合，因为中午的强光和高温常会使叶片发生光抑制，光合也会受到抑制.另外，中午的强光和高温会诱导叶片气孔关闭，影响光合效率.室内样品需人工光源光照至少2 h后测定，特定试验，根据实验设计自行掌握.

3.6 需对测定材料进行筛选

测定光合时，需选择具有代表性且生长一致的材料，如忽略材料间的差异，会导致光合数据标准差大，重复性差，数据不理想.长枝条植物应测定中部完全展开叶.株型分散的植物应测定相同叶位，角度、朝向一致的叶片.测定时应测定叶片中部并避开叶片的主脉.测定大田农作物时，尽量避开边行.小麦、水稻应测定旗叶，玉米测定穗位叶.如果测定样品是幼苗，应测定完全展开叶.

3.7 提供浓度稳定的CO2

CO2是光合作用的反应底物，直接影响反应速率，因此稳定的CO2浓度是获得稳定光合速率的必要前提.CO2浓度波动时，测定光合数据一定是错误的.缓冲瓶是保证大田测定光合时通入稳定的CO2浓度的重要装置之一，可避免风吹、人员呼吸和走动的影响.测试时，主机和缓冲瓶要隔开尽量远的距离，缓冲瓶需要放在主机的上风口，勿直接放在地上，防止进水，也可用杆支在空中，尽量减少人为因素的影响.

4 CIRAS-3光合仪日常维护和保养

4.1 主机

光合仪主机属于高精度易损设备，使用时要避免磕碰，勿直接放到地面上，严防仪器进水(包括缓冲瓶内进水)和大量灰尘.存储时要放置在安全干燥的地方，仪器在高温强光下使用时要给主机遮阴,避免仪器过热[9].

4.2 空气过滤装置

光合仪进气口需接上空气过滤装置，避免空气中的灰尘或颗粒物大量进入红外线CO2分析仪，影响分析仪的精度，从而降低测定数据的可信度，从源头上减少颗粒物的数量.空气过滤装置种类多且构造简单，只要能达到过滤灰尘或颗粒物的效果即可.

4.3 吸收剂

硅胶干燥剂变为黑褐色后置于烘箱中(80 ℃以下)烘至颜色恢复橘黄色即可，可重复利用.碱石灰吸收CO2后发生化学反应，无法恢复，不能重复使用.分子筛也不能重复利用，需及时更换.

4.4 叶室

仪器不用时叶室应打开存放，可避免叶室上下黑色方形橡胶圈因长时间挤压变形，导致叶室因密封不严而漏气.如果叶室密封不严，会导致测定数据极不稳定，重复性差，可信度严重降低.另外，长时间使用或放置都会导致叶室密封材料老化，建议叶室密封材料每年更换一次.定期检查叶室上的螺丝是否松动，若有松动，及时拧紧.

4.5 电池

光合仪长期亏电会导致锂电池储电功能大幅降低，影响电池使用寿命.建议仪器使用结束，要充满电后存放，尤其是冬季不经常使用时，需定期(45天左右)给电池充电并运行仪器4 h左右以排出湿气.

5 常见问题解决方法

5.1 光量子探头出现松动

叶室上PARe外置光量子探头如果松动，切记不要旋转，以免将内部连线拧断，应该用“502”或“401”等强力胶固定.

5.2 仪器开机后噪声大

仪器气路堵塞或者漏气会造成仪器开机后噪声大，此种情况下可以检查缓冲管是否受到挤压，检查后面吸收管接口是否全部插入仪器，检查吸收管黑色头的两侧黑色密封圈是否脱槽.

5.3 CO2r值不稳定

如果CO2r值持续下降，可能是CO2没有达到平衡，如把缓冲瓶刚从室内(CO2浓度较高)拿到室外(CO2浓度较低)，可等到CO2自动平衡，或将缓冲瓶盖子打开在空气中来回摆动加快平衡.如果CO2r值不断波动，在主机周围吹气，CO2r值会明显增加，说明主机内有气路管道断开造成漏气，可以打开前面板检查.

5.4 Tleaf值明显不正常

正常情况下，不控温时Tamb、Tcuv和Tleaf值相近，如果Tleaf值明显异常，可能是叶室红外辐射探头污染，此时可以对settings中“Temperature sensor measurement”项进行设定，将“IR sensor”改为“Energy balance”.

5.5 Gs出现9999或者Ci出现0

正常情况下，Gs在0～2 000之间，Ci值在0～CO2r之间.Ci值出现0，可能会伴随RH值高于70%的现象.首先检查H2Or值，如果H2Or高于20 kPa，则需要控湿，在Control项下调H2O Reference比例.如果H2Or低于20 kPa，则检查Tleaf或Tcuv是否与Tamb相近，如果异常说明温度检测异常，则需要联系维修.

6 结语

CIRAS-3光合仪作为便携式仪器常在野外使用，如果操作不当或使用错误，不但降低测试效率，也影响实验研究进度.保证仪器处于良好的运行状态，正确操作使用仪器，准确判断仪器测试状态，选择适宜的测试环境、时间和样品，注意日常维护和保养，延长仪器使用寿命，提高使用者的测试水平，可切实提高CIRAS-3光合仪的使用效率.