熟地黄的炮制及有效成分和微量元素的检测研究

陈胜强 ，杨克培 ，康文利 ，周永昌 ，陶思曼 ，关伊辰 ，蒲秀瑛

（1.兰州理工大学，甘肃 兰州 730050；2.甘肃农垦药物碱厂有限公司，甘肃 兰州 730000）

熟地黄为玄参科植物地黄的块根，又名伏地，经加工炮制而成.熟地黄具备补血滋阴功效，可用于血虚萎黄、眩晕、心悸失眠、潮热骨蒸、盗汗、遗精等病症，是非处方药六味地黄丸主要成分之一.通常以酒、砂仁、陈皮为辅料经反复蒸晒，至表里色黑油润，质地松软黏腻.常切片或炒炭入药[1].

目前可参照的黄酒蒸制熟地黄工艺步骤为：将洗干净的生地黄放入桶内，加入黄酒搅拌均匀后静置，待黄酒被充分吸尽，取出，晾晒至外皮黏液稍干时，切厚片，干燥即得熟地黄.陈子月等[2]描述的高压炮制时间过长，产品不合格率较高.张丽萍等[3]描述的炮制工艺中黄酒质量不可控，且操作缺乏客观可控的技术参数指导，无法精确控制其工艺，致使人为因素偏多，所得熟地黄中5 种苷类成分（梓醇、地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷）含量相差很大，有益微量元素含量偏低，有害微量元素超标.徐廉松等[4]研究的双波长含量检测方法基线不稳定，且分析时间过长，所测得苷类成分含量不稳定.刘明等[5]研究熟地黄质量标准时未涉及微量元素的研究.本研究采用的水蒸制“七蒸七晒”炮制方法可有效增加熟地黄中铁、锌、铜微量元素含量，同时降低镉、砷有害元素含量.此外，梓醇、地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷及多糖含量较高.

1 仪器与试剂

仪器：蒸煮锅（ZYG-700，南京润邦机械科技有限公司）；卤素快速水分测定仪（XF-720MA，厦门雄发仪器）；高效液相色谱仪Waters 2695（沃特世科技有限公司）；安捷伦电感耦合等离子体质谱仪（7800，安捷伦科技（中国）有限公司）；微波消解仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；紫外分光仪（ZF-7，上海金达生化仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE52CS，上海亚荣生化仪器厂）.

试剂：乙腈（MERCK 公司，色谱纯）；水为自制纯水；磷酸（山东西亚化工，≥85.0%）；浓硫酸（国药，95.0%～98.0%）；苯酚（国药，≥99.0%）；无水乙醇（国药，≥99.8%）；葡萄糖标准品（Solarbio，≥98%）；硝酸（国 药，65.0%～68.0%）.砷 单 元 素 标 准 溶 液（GBW08611-18126，中国计量科学研究院，1 000µg/mL）；锌单元素标准溶液（199018，国家有色金属及电子材料分析测试中心，1 000 µg/mL）；铝单元素标准溶液（19106，中国计量科学研究院，1 000µg/mL）；镁单元素标准溶液（19C008，国家有色金属及电子材料分析测试中心，1 000 µg/mL）；镉单元素标准溶液（08614-17012，中国计量科学研究院，1 000 µg/mL）；铁单元素标准溶液（29018，国家有色金属及电子材料分析测试中心，1 000 µg/mL）；铜单元素标准溶液（GBW(E)080122-17071，中国计量科学 研 究院，1 000 µg/mL）.梓醇 对 照品（Solarbio，≥98%）；地黄苷D 对照品（Solarbio，≥98%）；益母草苷对照品（Solarbio，≥98%）；异毛蕊花糖苷对照品（Solarbio，≥98%）；毛蕊花糖苷对照品（Solarbio，≥98%）.

2 试验方法

2.1 熟地黄的炮制

将清洗干净的生地黄在全自动蒸汽发生装置中进行蒸制（蒸制压强为0.35～0.5 MPa），每次蒸制4 h，得到蒸制地黄.然后将蒸制地黄在太阳棚中进行干燥（干燥温度为50～70 ℃，需具有良好的换气设施），且每隔2 h 翻料1 次，得到干燥地黄.按照上述步骤重复蒸制和干燥7 次，得到“七蒸七晒”的熟地黄.

2.2 苷类成分的测定

2.2.1 溶液配制

混合对照品溶液1：取梓醇对照品5 mg、地黄苷D 与益母草苷对照品各7 mg，分别用25%甲醇溶液稀释定容至50 mL 容量瓶中，再稀释成质量浓度为50 µg/mL 的溶液.

混合对照品溶液2：分别取异毛蕊花糖苷对照品、毛蕊花糖苷对照品适量，用25%甲醇溶液稀释成质量浓度为50 µg/mL 的溶液.

供试品溶液：取“七蒸七晒”的熟地黄0.5 g置于具塞锥形瓶中，加入20 mL 25%甲醇溶液溶解，超声提取1 h 后过滤，再经0.45 µm 滤膜过滤，即得.

2.2.2 高效液相色谱（HPLC）条件

色谱柱：Waters Symmetry® C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：0.3%磷酸溶液（A）∶乙腈（B）（体积比为97∶3）；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 µL；梓醇、地黄苷D、益母草苷检测波长：210 nm；异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷检测波长：334 nm[6]；各峰的理论塔板数不低于5 000.

2.3 多糖含量的测定

精密称量5 g 熟地黄置于锥形瓶中加100 mL纯水溶解，沸水浴回流提取，每次2 h，提取2 次，8层纱布趁热过滤，减压浓缩至50 mL 左右，80%乙醇醇沉，减压干燥，得到熟地黄多糖，称量熟地黄多糖，按式（1）计算多糖提取率.采用苯酚-硫酸法进行熟地黄多糖提取率的测定[7-8].

式（1）中：m为熟地黄多糖提取物质量（g），M为熟地黄样品质量（g）.

2.4 微量元素的测定

2.4.1 溶液配制

配制铁、砷、锌、铝、镁、镉、铜标准溶液，其质量浓度均为10 µg/mL[9].

供试品溶液：精密称量0.3 g 熟地黄粉末于消解管中，精准加入3 mL 硝酸，置于微波消解仪中进行样品消解54 min，待消解完成后放置室温30 min[10].将消解后的样品使用超纯水冲洗3 遍，移入50 mL 容量瓶，定容至刻度，摇匀备用.

铁、砷、锌、铝、镁、镉、铜标准曲线：分别量取所配制的铁、砷、锌、铝、镁、镉、铜元素标准溶液0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、2.0 mL 置于100 mL 聚四氟乙烯容量瓶中[11]，补加2%硝酸至100 mL，摇匀，即得.

使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS），载气为氩气[12-13]，以待测元素浓度（X）为横坐标、待测元素与所选内标元素响应信号值的比值（Y）为纵坐标绘制上述元素标准曲线，计算线性回归方程.

2.4.2 样品微量元素上机检测

将空白溶液和试样溶液分别注入电感耦合等离子体质谱仪中，测定待测元素和内标元素响应信号值，根据标准曲线得到消解液中待测元素的浓度[14].

试样中待测元素的质量分数或质量浓度计算如式（2）：

式（2）中：c为试样中待测元素的质量分数或质量浓度，mg/kg 或mg/L；ρ 为试样溶液中被测元素质量浓度，µg/L；ρ0为试样空白溶液中被测元素质量浓度，µg/L；v为试样消化液定容体积，mL；f为试样稀释倍数；m为试样称取质量或移液体积，g 或mL；1 000 为换算系数.

3 结果与讨论

3.1 性状

经“七蒸七晒”的熟地黄，色漆黑，外表皱缩不平，质柔软，断面滋润，黏性较大，味较甜.

3.2 HPLC 测定5 种苷类成分的方法学验证

3.2.1 方法的线性范围、检出限和定量限考察

取适量2.2.1 项下所配制的梓醇、益母草、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷混合对照品溶液于进样小瓶中，按进样量依次进样2、4、8、10、12、16、20 µL[15]，以各成分色谱峰面积（y）为纵坐标，进样质量浓度（x）为横坐标分别绘制5 种对照品的标准曲线.检出限以信噪比（S/N）为3 对应的质量浓度建立，定量限以S/N 为10 对应的质量浓度建立.结果如图1 所示，5 种苷类成分在1～20 mg/L 质量浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99，方法检出限为0.33～3.30 mg/L，定 量限为1.0～10.0 mg/L，说明该方法能够满足对5 种苷类成分的分析.

图1 （a）梓醇，（b）益母草苷，（c）地黄苷D，（d）毛蕊花糖苷，（e）异毛蕊花糖苷的对照品标准曲线Fig.1 Standard curves of (a) Catalpol, (b) Leonuride, (c) Rehmannioside D, (d) Acteoside, (e) Isoacteoside

3.2.2 精密度与重复性考察

取适量2.2.1 项下所配制的梓醇、地黄苷D、益母草、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷混合对照品溶液于进样小瓶中，按2.2.2 项下色谱条件，水平连续进样6 次[16]，计算方法的精密度[相对标准偏差（RSD）].精密称取同一批熟地黄样品粉末6 份，以峰面积RSD 计算方法的重复性[17].精密度考察中，梓醇、地黄苷D、益母草、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷峰峰面积RSD 分别为0.16%、0.17%、0.24%、0.24%、0.22%.重复性考察中，梓醇、地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷含量RSD 值分别为6.89%、5.36%、3.21%、6.62%、7.54%.上述数据表明本试验方法精密度与重复性良好.

3.2.3 稳定性考察

取适量2.2.1 项下所配制供试品溶液于进样小瓶中，分别于0、2、4、8、16、20 h 进样[18]，以峰面积RSD 值确定样品的稳定性.供试品溶液中梓醇、地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷在20 h 内峰面积的RSD 分别为2.29%、0.69%、0.81%、1.97%、1.83%.表明供试品溶液在20 h 内稳定性良好.

3.2.4 加标回收率考察

取适量2.2.1 项所配制供试品溶液于进样小瓶中，向供试品溶液中分别精密加入梓醇、地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品溶液，每份样品均做平行样[19]，以峰面积RSD 计算样品加标回收率，结果如表1 所列.梓醇、地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷平均回收率在98.08%～101.09%之间，RSD 在0.19%～3.07%之间，试验方法回收率高，能够满足熟地黄中5 种有效苷类成分的检测要求.

表1 5 种苷类成分的加标回收率试验结果Table 1 Results of spiked recovery of 5 glycoside components

3.3 ICP-MS 测定微量元素的方法学验证

按2.4 项下方法对铁、砷、锌、铝、镁、铬、铜标准曲线进行ICP-MS 方法学验证.结果如表2 所列，7 种微量元素在相应质量浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数均大于0.98，方法检出限为0.002 0～1.001 2 µg/g，定量限为0.004 9～3.000 1 µg/g，能够满足7 种微量元素的检测分析.

表2 7 种微量元素方法学参数Table 2 Methodological parameters of 7 trace elements

3.4 不同炮制工艺下熟地黄中有效成分的检测结果对比

3.4.1 苷类成分含量的测定

采用上述HPLC 分析方法，对不同炮制工艺下熟地黄中5 种有效苷类成分进行含量检测，结果如图2 所示.“一蒸一晒”至“七蒸七晒”，随蒸晒次数的增加熟地黄中5 种有效苷类成分含量呈上升趋势，“七蒸七晒”至“九蒸九晒”，随蒸晒次数的增加熟地黄中5 种有效苷类成分含量无明显变化.以传统“黄酒蒸制”熟地黄中5 种有效苷类成分含量作为对照，“七蒸七晒”熟地黄中5 种有效苷类成分含量显著高于传统“黄酒蒸制”工艺.

图2 不同炮制工艺下熟地黄中5 种有效苷类成分含量的变化（不同小写字母表示差异显著，p ＜ 0.05）Fig.2 Changes of content of 5 active glycosides in Radix Rehmanniae Praeparata under different concoction processes (different lowercase letters indicate significant differences, p ＜ 0.05)

3.4.2 多糖含量的测定

按2.3 项下方法对葡萄糖标准曲线进行方法学验证.结果如图3 所示，葡萄糖在0.01～0.10 mg/mL质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.99，方法能够满足多糖的测定.

图3 葡萄糖标准曲线Fig.3 Standard curve of glucose

熟地黄多糖提取率按公式（1）计算，得到“一蒸一晒”至“九蒸九晒”过程中葡萄糖质量分数分别为3.05%、6.41%、11.59%、5.51%、10.23%、10.35%、11.84%、9.02%、18.37%.“一蒸一晒”至“七蒸七晒”，随蒸晒次数的增加熟地黄多糖含量呈上升趋势，“七蒸七晒”至“九蒸九晒”，随蒸晒次数的增加熟地黄多糖含量呈下降趋势.其中“七蒸七晒”得到的熟地黄中多糖质量分数最高，多糖质量分数为30.10%.而“黄酒蒸制”得到的熟地黄中多糖质量分数仅为22.91%.

3.4.3 微量元素的测定

如图4、5 所示，铁、砷、锌、铝、铅、镉、铜元素在“一蒸一晒”至“九蒸九晒”中的质量分数变化图，随蒸晒次数的增加，锌、铜、铁、镉微量元素含量呈现先上升后下降的趋势，镉、砷、铅含量随着蒸晒次数逐渐降低.

图4 不同炮制工艺下熟地黄中有害微量元素含量的变化Fig.4 Changes of content of harmful trace elements in Radix Rehmanniae under different concoction processes

图5 不同炮制工艺下熟地黄中有益微量元素含量的变化Fig.5 Changes of content of beneficial trace elements in Radix Rehmanniae under different concoction processes

据文献报道[20]，铁元素作为血红蛋白的核心部分，可以补充机体对铁的大量需求.在“七蒸七晒”炮制工艺下，铁与锌含量较高，不仅可以满足机体对铁与锌的需求，同时还可以调整体内铜、锌比值，增强机体氨基酸的代谢能力.通过2.4 项下方法测定，“七蒸七晒”得到的熟地黄中微量元素铁、锌、铜的质量分数分别为1 763.40、62.77、17.39 µg/g，“黄酒蒸制”得到的熟地黄中微量元素铁、锌、铜的质量分数分别为860.50、21.25、12.32 µg/g.其中铁、铝、锌是所测定的7 种元素中含量较高的元素.同时，随炮制工艺中蒸晒次数的增加，有害元素镉、砷、铅含量不断降低，可减少有毒物质在人体软组织中的积累.“七蒸七晒”炮制工艺与传统“黄酒蒸制”工艺相比，有益微量元素含量更高，有害元素更低，为“七蒸七晒”工艺炮制而成的熟地黄更加安全、可靠的用药提供了相应的理论支持.

4 结论

本文通过水蒸制“七蒸七晒”炮制工艺制得熟地黄，其中梓醇、地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷含量均高于“黄酒蒸制”工艺.同时有益微量元素铁、锌含量均高于“黄酒蒸制”工艺，有害微量元素砷含量低于“黄酒蒸制”工艺，表明在新工艺条件下“七蒸七晒”炮制熟地黄的工艺方法具有提高各苷类主成分含量，提高有益微量元素含量，降低有害微量元素含量的显著优势.

使用蒸汽压强约为0.35 MPa，蒸制4 h 干燥过程中每2 h 翻料一次，经太阳棚曝晒干燥至快速水分测定仪检测水分不高于30%的“七蒸七晒”炮制工艺，此工艺炮制的熟地黄5 种苷类成分含量高，多糖含量相对稳定，且有益微量元素铁、锌、铜含量最高，有害微量元素砷、镉、铅含量低.HPLC 等分析方法具有分离效果好，测定简单，数据准确等优势，避免了熟地黄的浪费，为后期深入研究熟地黄提供了有力参考.