水环境中微囊藻毒素分析技术新进展

尚晓艳，劳文剑，谭江坤，常 芮，纪仲胤，孙志伟，李 赞，张世娟，尤进茂,3

(1.山东省生命有机分析重点实验室，曲阜师范大学 化学与化工学院，山东 曲阜 273165；2.南加州海岸水环境研究所，美国加利福尼亚州 科斯塔梅萨市 92626；3.中国科学院 西北高原生物研究所 藏药研究重点实验室，青海 西宁 810008)

微囊藻毒素(microcystins，MCs)是目前已知有害藻华产生频率最高、产量最大、具有强有效多种器官毒性[1-2]的蓝藻毒素.蓝藻细胞裂解和死亡后，MCs被释放出来进入水、沉积物中，通过水生生物的呼吸作用、皮肤接触和食物链、食物网进入生物以及动物组织中，进而进入人体，对人类的生活健康造成巨大威胁[3].目前，已经有多起蓝藻毒素中毒事件被报道，因此分析检测MCs有着重要的现实意义.

分析环境中MCs的水平是研究和监测它们的重要部分.在这个领域，已经开发了多种方法并付诸应用，其中包括酶联免疫法[4]和液相色谱法[5]等.由于MCs的多样性，开发和应用富集、萃取、净化和分析环境介质中MCs的方法仍然是一个有吸引力的领域.除了不断发表的研究报告以外，也有一些文献综述发表[6].但是目前还没有有关利用被动采集方法富集和利用化学衍生化方法改善检测性的综述.本文在简要介绍MCs的来源、结构和理化性质的基础上，综述了分析MCs的方法，重点介绍了近年来被动采样方法和化学衍生化方法分析环境中(水和沉积物)MCs的方法进展，以期为后续研究者提供参考.

1 MCs的来源、结构和理化性质

MCs是蓝藻衰败过程中产生的主要有害的蓝藻毒素，MCs是由5个不变的氨基酸和2个可变的氨基酸组成的单环七肽，它的主要结构是环D-丙氨酸(Ala)-R1-R2-赤-ß-甲基-D-异天冬氨酸(MeAsp)-L-Z-Adda-D-异谷氨酸(Glu)-N-甲基脱氢丙氨酸(Mdha)[7-8].Adda (3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯)是一种特殊的 20 个碳原子的氨基酸，是生物活性表达所必需的基团[9].MCs的命名是基于对两个可变氨基酸(R1，R2)的单字母编码[10]，具体结构如图1所示.由于R1和R2的不同及3，7位上氨基酸的甲基化或去甲基化，形成了多种MCs异构体，国内外研究较多的MCs种类为MC-LR、MC-RR、MC-YR(L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸)等[11].MCs毒性大、分布广，其相对分子质量大约为1 000，具有很强的亲水性和高耐热性，易溶于水，正常情况下其性质稳定，能够在水体中存在相当长的时间，在一定条件下会发生降解，如紫外、超声等.

图1 微囊藻毒素的一般结构Fig.1 Structure of microcystin

2 不同基质样品中MCs的采样、富集和净化

2.1 水样

传统的分析MCs的样品制备方法是基于在特定的单一时间点采集样品，样品经固相萃取进行浓缩和净化.一般地，水样(500～1 000 mL)经0.7 μm玻璃纤维滤膜过滤去除悬浮物，以固相萃取小柱(Oasis HLB 6 mL/500 mg或C18)对MCs进行富集.富集完毕，甲醇洗脱、氮吹浓缩，再经0.22 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)滤膜过滤，-20 ℃保存待测.传统的主动采样技术有几个缺点：(1)采用固相萃取小柱不能处理大体积的样品.(2)在环境中，MCs的浓度可能随时间而变化，主动采样方法只能得到采样时的瞬时浓度，不能够反映MCs的平均水平.(3)所得到结果不是生物有效性浓度.

被动采样技术是把被动采样器放置在野外暴露数天或者数周后能有效地积累目标污染物的一种新技术，基于物质化学势梯度引起的被检测物质从环境本体到接受相(receiving phase)的自由传质，根据不同的目标污染物选择不同的接受相吸附剂、微孔膜等进行采样.被动采样技术可以弥补传统采样技术的缺点，它可以原位富集目标化合物，可以获得更低的检测限，可以测量时间加权平均(TWA)浓度和生物有效性浓度[12-14].目前分析MCs所采用的被动采样器主要有极性有机化合物一体化采样器(polar organic chemical integrative sampler, POCIS)、固相吸附毒素追踪技术(solid phase adsorption toxin tracking, SPATT)和有机-梯度扩散薄膜技术(organic-diffusive gradients in thin films,o-DGT)等.

POCIS采样器[15-16]是由包含吸附剂的两片圆形聚合物薄膜构成，聚醚砜薄膜和亲水亲脂平衡的逆相吸附剂(Oasis HLB)是最常用的配置[17].POCIS取样器的最初设计是为了模拟水生生物与溶解的化学物质接触，消除新陈代谢、净化化学物质、避免污染区域和生物的死亡问题，主要是针对极性的(0

SPATT技术[25-26]使用包含吸附剂的袋子来被动富集水中的MCs.该技术由MacKenzie[27]于2004年提出，是用于监测海水中生物毒素-扇贝毒素(pectenotoxins)和软海绵酸(okadai cacid)的水平，所采用的吸附剂是非极性的DIAON HP20树脂(苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物).随后SPATT技术被用来检测更多的藻毒素，例如大田软骨藻酸(domoic acid)、石房蛤毒素(saxitoxin)等[28-29].同时也考察了更多的吸附剂，譬如SP700、L-439、XAD4、SP850等.直到2011年，Miller和Kudela等[30]应用HP20 SPATT技术来研究海洋中MCs对水獭肝脏的损害.紧接着，Kudela[31]进一步考察了HP20 SPATT作为被动采样技术富集淡水和海水中的MCs，发现HP20 SPATT对MC-RR、MC-YR、MC-LR、MC-LA具有非常好的吸附和洗脱性能.随后，中国海洋大学的Zhao等[32]也考察了HP20对MC-LR和[Dha7]MC-LR在淡水中的吸附和使用甲醇水溶液的洗脱性能，并和SP700吸附剂进行了比较，结果推荐使用HP20树脂作为SPATT的吸附剂.2014年，Gibble等[33]报道了在美国加州蒙特利海湾的陆-海交界区，应用SPATT检测MCs的含量和随时间、营养物(氮磷)、碱度以及温度的变化关系.随后一直到现在，SPATT更多地被人们应用在有关MCs的环境监测和风险评价的研究中.例如，Howard等[34]报道了在美国南加州的水体中应用SPATT检测MCs，发现传统的单点采样方法低估了MCs的水平.Peacock等[35]应用其检测旧金山湾淡水和海洋藻类等毒素.Onofrio等[36]建立了从SPATT萃取液中，基于超高效液相色谱-串联质谱联用技术(UHPLC-MS/MS)检测和筛选多种藻毒素的方法.一般地，SPATT袋由尼龙纱布(Bolt Cloth-Nitex, 100 μm孔径)制成.SPATT袋一般有两种外形，一种是类似茶叶袋的方形，另一种是用塑料刺绣箍做成的圆形.装有HP20树脂的SPATT袋子在100% HPLC级甲醇中浸泡24 h活化后，使用超纯水(Milli-Q)或二次蒸馏水冲洗以清除甲醇，然后保存在4～6 ℃的Milli-Q中备用.现场使用时，将SPATT袋子固定在采样点位处数小时至数周.在回收SPATT袋时，将SPATT袋放入塑料袋中保存，然后在装有冰的袋子容器中运往实验室，在-20 ℃的冰箱中保存.吸附在SPATT吸附剂上的MCs使用50%的甲醇水溶液洗脱.HP20的吸附适合使用Freundlich吸附曲线描述，但是由于吸附受吸附剂孔径、盐度的影响，还没有被很好的校准.因此，SPATT目前还是一个半定量的方法.MCs的浓度表示为纳克每克干树脂(ng/g dry resin)，不能够直接转换成水浓度(μg/L).即便如此，不影响使用SPATT来表征MCs的相对含量和随时间的变化[37].此外，Kudela[31]推荐使用10∶1的比例来粗略估算水中浓度，即SPATT的10 ng/g dry resin相当于水中1 μg/L的浓度.新的吸附材料、不同的洗脱和净化方法、室内和现场的校准定量以及规范化使用是SPATT继续发展的热点.

除了有外层的保护膜外，POCIS和SPATT的一个共同点是都只有吸附剂作为被采样化合物的接受相，水中的自由溶解态化合物在穿过保护/过滤膜之后，直接被吸附剂吸附.而o-DGT技术在接受相(也叫固定膜或结合胶，binding gel)外面还有一层扩散胶层(diffusive gel)，因而是一个两相系统.水中的自由溶解态化合物通过扩散，穿过扩散层到达接受相，随即被捕获进而富集起来.其定量基于菲克(Fick)扩散第一定律[38]，可以在原位状态下反映水体或土壤中目标化合物的存在状态和迁移行为[39].DGT由Davison和Zhang[40]于1994年发明，最初是用来测定淡水中溶解的金属[41-42]，其接受相、扩散层以及外侧避免待测环境中的颗粒物进入装置的滤膜可以根据试验目的选择不同的材质.2011年，Bondarenko等[43]首次把DGT应用于有机化合物的检测.2012年，Chen等[44]首次使用o-DGT技术和XAD18接受相检测水中的抗生素.但是，直到近年才被用于检测水中MCs的浓度.2019年Yao等[45]采用HLB/琼脂糖凝胶作为接受相，琼脂糖凝胶作为扩散相的DGT装置对太湖梅良湾的MC-LR进行检测，并与传统的主动取样进行了比较.被动取样所测得的浓度在主动取样的最小与最大值之间，表明HLB与DGT结合适合检测水中的MC-LR.同年，D’Angelo[46]也考察了DGT技术检测淡水和海水中的MC-LR，结合采用酶联免疫法测定MC-LR，对三种吸附剂(HP20、SP700和XAD18)的吸附动力学、吸附容量和吸附效率进行了比较，也评价了两种保护膜(尼龙膜和聚醚砜膜).结果显示，XAD18接受相和聚醚砜膜扩散相是较好的o-DGT组成.通过DGT检测，可以得到水中化合物的质量浓度(μg/L)，但是它的定量依赖于目标化合物的扩散系数.因此测定扩散系数是建立DGT方法的重要步骤.目前只有Yao等[45]试验测定了MC-LR的扩散系数.可以看出，目前利用o-DGT来分析水中的MCs的研究才刚刚起步，还有很多方面需要探索.

此外，其它类型的被动采样器或吸附剂也有报道.例如，Nyoni等[47]研究了硅膜/γ-Fe2O3被动采样器，用于检测环境水中MC-LR、MC-RR、MC-YR.Li等[48]研究了核-壳结构的磁性金属-有机框架材料富集水中的MC-LR.被动采样技术可以克服主动采样方法的不足，是对水和生物样品直接取样的补充.但被动采样器也有着不足之处，它只能测量水中自由溶解的MCs浓度，无法测量细胞或颗粒物中的MCs.

2.2 沉积物

在水环境中，沉积物是MCs的一个重要的归趋场所.制备沉积物中MCs的样品主要有超声萃取和加速溶剂萃取(ASE)法.

Song等[49]采用超声萃取法提取沉积物中的MCs，使用SPE(Oasis HLB，6 mL/500 mg)进行浓缩，保存至分析.Zastepa等[50]和张蓓蓓等[51]采用加速萃取法提取沉积物样品中的MCs.将沉积物样品与硅藻土搅拌混匀置于加速溶剂萃取池中，以甲醇-水为萃取溶剂，以80 ℃(各目标物回收率随温度的增加而提高，80～90 ℃达到平缓状态)和13.1 MPa(目标物随着萃取压力升高回收率显著提高，13.1 MPa时最佳.压力增大，基质干扰物的萃取效率提高，萃取液颜色明显加深，不利于净化效果，回收率略有下降)为萃取温度和压力进行萃取.将萃取液转移至活化的HLB固相萃取小柱进行富集净化，洗脱氮吹，过0.22 μm PVDF滤膜，保存至分析.

2.3 水生生物

水产品样品主要以水产动物的肌肉、鱼等食用组织样本为主，检测时要使用适当的溶剂和辅助手段将MCs从待测样本中转移至易于净化和分析的溶液中.为了使水产品组织中的MCs更好的溶于溶剂中，需将样本匀浆或冻干后研磨粉碎，以便于充分的提取.常用的提取剂主要有正丁醇-甲醇-水(体积比为1∶4∶15)、不同浓度的甲醇水溶液、5%的醋酸水溶液、酸化的甲醇溶液等.辅助手段有漩涡、振荡、热水浴、微波辅助提取(MAE)和ASE等.

虞锐鹏等[52]使用正丁醇-甲醇-水(体积比为1∶4∶15)作为萃取剂，超声作为辅助萃取方式，氮吹浓缩后乙腈或者甲醇定容，经0.22 μm滤膜过滤后分析.吴振兴等[53]采用60%的甲醇水溶液提取，且离心分离后使用甲酸和稀氨水调节溶液的pH.通过调节pH等手段去除色素和絮状物，降低样品的基质效应.张玲玲等[54]采用的是85%甲醇水溶液作为提取剂，加速溶剂辅助萃取，氮吹浓缩后，35%甲醇水溶液定容，再经0.22 μm滤膜过滤进行分析.Hu等[55]采用5%的醋酸溶液与80%甲醇水溶液混合提取鱼组织中的MCs.固相萃取柱浓缩，100%甲醇洗脱，旋转蒸发干燥后水溶解保存至分析.

水产动物组织基质复杂，提取液经过离心或过滤等简单处理过程，不能完全去除脂肪、蛋白等大分子，需要进一步合理、可靠的净化手段获得纯度较高的净化液，以减少基质干扰带来的偏差和对精密分析仪器的污染.

3 MCs的检测方法

MCs目前有许多检测方法，免疫检测法如酶联免疫分析(ELISA)法[56-57]和蛋白磷酸酶抑制分析(PPIA)法[58]，化学法如高效液相色谱(HPLC)法[59]、液相色谱-质谱联用(LC-MS)[60]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、2-甲基-3-甲氧基-4-苯丁酸(MMPB)法[61-62]等.免疫检测法无法提供结构变异的信息，只能测MCs总量，但该法会出现假阳性反应，导致含量偏高.HPLC、LC-MS、GC-MS和MMPB检测法检测MCs大多依赖标准品，标准毒素的缺乏会低估毒素的含量，进而限制了这些方法的进一步使用.样品中的基质比较复杂，仅过滤和净化作用不强，可能会给仪器带来污染，造成响应下降.衍生化方法可以减少样品基质的影响，降低基质效应.且紫外分光光度法和荧光分光光度法成本较低，耗时较短，相比较来说比其他方法受欢迎.MCs衍生反应位点共有6个，如图2所示.

图2 MCs的6个衍生反应位点Fig.2 Six derived reaction sites of MCs

反应位点1为精氨酸末端的胍基基团.Grundler等[63]利用胍基的固有反应性以及巴顿碱能够匹配其反应性，保证能够完全的去质子化和对酰化剂的有效的后续的亲核攻击，制备了MCs的生物素化化合物和重氮唑啉探针.次年，Grundler等[64]荧光标记MC-LR的精氨酸，得到MC-LR-(5.6-FAM)、MC-LR-(Alexa-430)、MC-LR-(Texas Red)、MC-LR-(Alexa-488)等4种衍生产物.再经LC-MS检测(如图3所示).

图3 胍基反应的衍生物Fig.3 Guanidine reactive derivative

反应位点2为MCs的两个羧基基团.Hayama等[65]采用固相萃取法预处理水样后，使用4-(1-芘)丁酸肼(PBH)与羧基柱前衍生检测水中的MCs，然后进行液相色谱-荧光检测.在准分子荧光波长(440～540 nm)上选择性地检测衍生物，试验结果表明，MCs的检出限在0.4～1.2 μg/L之间，定量限在1.4～3.9 μg/L之间(如图4所示).

图4 羧基反应的衍生物Fig.4 Carboxyl reactive derivative

反应位点3为末端双键.Murata等[66]建立了一种高效液相色谱过氧草酸酯类化学发光法(HPLC-PO-CL)检测衍生的MCs，N-甲基脱氢丙氨酸的α，β-不饱和羰基与半胱氨酸的巯基进行亲和加成，通过半胱氨酸引进了第三个羧基基团，使其对pH的变化更加敏感，该法检出限为1.5×10-14mol/L(S/N为10).Miles等[67-68]发现含有Mdha或Dha的MCs在碱性条件下可以与硫醇荧光团反应，与不含带电基团且与MCs本身具有相似极性的硫醇进行衍生化，得到的衍生物与相应的低浓度MCs具有相似的保留时间、电离和质谱裂解特性，利用LC-MS进行定性分析，很大程度不会受到干扰，且会简化LC-MS色谱图(如图5所示).

图5 末端烯反应的衍生物Fig.5 Terminal ene reactive derivative

反应位点4、5为共轭二烯.Harada等[69]使用液相色谱荧光、化学发光检测衍生的MCs，衍生试剂4-[2-(6，7-二甲氧基-4-甲基-3-氧-3，4-二氢喹啉基)乙基]1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(DMEQ-TAD)与Adda基团的共轭二烯反应，生成两个加合物的立体异构体，通过ODS柱去除衍生后过量的试剂.对MC-LR、MC-RR，液相色谱荧光的检测限分别为1.0×10-10g、6.5×10-11g，化学发光的检测限分别为5.0×10-10g、2.5×10-9g(如图6所示).

图6 共轭二烯反应的衍生物Fig.6 Conjugated diene reactive derivative

将MCs的活泼双键(反应位点5)氧化成MMPB，再利用羧基基团(反应位点6)进行衍生化反应也是检测MCs的常用衍生化方法.Sano等[70]采用高锰酸钾、偏碘酸钠等氧化剂将蓝藻中的MCs氧化成MMPB，使用2-(2，3-萘酰亚胺)三氟甲烷磺酸乙酯(NE-OTf)荧光标记后进行HPLC分析，测定了fmol浓度范围内的MMPB.同时使用气相色谱法测定了利用14%三氟硼酸甲醇溶液将MMPB转化成的pmol范围内的甲酯.两种方法都能有效的测定MCs的总含量.Tsuji等[71]采用了臭氧分解成MMPB、14%的三氟化硼-甲醇衍生和GC-MS法分析沉积物中的MCs，总分析时间短，分析结果良好.MC-LR、MC-YR、MC-RR的回收率分别为90.5%、91.7%、90.0%，检出限约为0.1 μg/g.Zhang等[62]采用臭氧氧化成MMPB，氯甲酸甲酯(MCF)甲基化和GC-MS法测水中的MCs，线性范围宽，灵敏度高，检出限为0.34 μg/L.Wang等[72]将水和沉积物中的MCs氧化成MMPB后浓缩，与1，2-苯并-3，4-二氢卡巴唑-9-乙基对甲苯磺酸(BDETS)衍生，然后进行液相色谱荧光检测，水和沉积物的定量限是125 ng/L和100 ng/g(如图7所示).

图7 MMPB羧基反应的衍生物Fig.7 MMPB carboxyl reactive derivative

4 结论与展望

水体中MCs的含量与藻类有关，藻类生长的水温、氮磷营养盐等因素都会影响水体中MCs的浓度.不同地区、不同湖库由于其自身特征，其环境差异会影响MCs的含量[73-77].日益严重的水体富营养化，使得MCs的污染成为全球性环境问题, 世界卫生组织(WHO)规定饮用水中总MC-LR的限值为1 μg/L.中国现行的《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)和《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)中规定MC-LR的限值为0.001 mg/L.美国国家环境评估中心建议将饮用水指南值降低至0.1 μg/L.

我国大部分地区如无锡太湖、云南滇池和太原市地表饮用水、饮用水体中[78-80]的MCs含量低于中国现行的《生活饮用水卫生标准》和《地表水环境质量标准》中规定MC-LR的限值，但气候和环境等各方面的变化会导致MCs含量的增加.国外水域环境中MCs污染情况也较为普遍，如意大利撒丁岛卡里奇泻湖和卡布拉斯泻湖、埃塞俄比亚科卡水库、哥伦比亚安蒂奥基亚东部的三个水库、加拿大的地表水、芬兰湾等[81-84].陈瑾等[85]应用物种敏感性分布方法(SSD)评估了MCs对淡水生物的生态风险浓度阈值(HC5)和复合潜在影响比例(msPAF).在大多数情况下，受污染的水域中MCs的质量浓度小于10 μg/L.该浓度下除甲壳类的其余物种的PAF值均小于5%，MCs对全部物种的HC5为19.22 μg/L，表明该浓度的水域中的MCs对淡水生物的影响很小.部分地区的MCs浓度较大，会严重影响淡水生物，进而影响人类健康.因此，开发一种高效的、有选择性的被动采样技术及简单、灵敏的检测技术监测水体中MCs的残余量、评估水环境中的MCs的风险至关重要.

被动采样技术在采样过程更具灵活性和代表性，可以连续采样，不需要如传统方法采集大量样品，大大降低了采样成本.被动采样技术不受一些外界因素，如时间、突发污染事件等的限制，可以及时收集污染物信息，监控应对各种环境中的紧急污染状况.被动采样技术还可以避免在采样及转移过程中目标污染物的形态发生变化而影响分析结果的准确性.但其发展不完善，存在着诸多的问题，主要表现为：(1)采样率受环境的影响，无法获得准确的采样率.(2)选择PRC校准物质困难.(3)无法准确测定目标化合物的扩散系数.(4)针对不同的目标污染物，研发高选择性吸附剂困难.(5)选择合适的洗脱和净化方法较困难.(6)缺乏检测沉积物中的MCs的被动采样技术.因此被动采样技术的发展仍是环境监测工作中的一个重点.

和已有的一些非衍生化分析检测MCs的标准方法相比，衍生化的分析方法可以减少样品基质的影响，降低基质效应.但由于MCs的分子量过大，衍生化试剂与其反应比较困难，研发一种反应活性高、衍生化时间短、洗脱能力强的衍生化试剂对MCs的检测具有重要的现实意义.

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