石油降解菌的复配及降解效果评价*

李小康，鱼 涛，李 红，杜明明，屈撑囤，2

（1.西安石油大学陕西省油气田环境污染控制技术与储层保护重点实验室，陕西西安 710065；2.石油石化污染物控制与处理国家重点实验室，北京 102206）

0 前言

石油烃化合物作为不同行业的主要能源和材料，由于用途较广、使用量大，导致石油类物质每年大量流入土壤和水体中，对生态环境产生负面影响［1-2］。石油物质引起污染的途径很多，主要包括石油大规模生产、运输、炼制、航运活动、意外溢油等［3］。若不及时治理，这些污染会不断向周围环境扩散，并在新的环境中积累而达到较高的污染水平，给环境中的生命构成直接或间接的健康危害［4-5］。石油污染物被列为污染广泛的有毒化合物［6］。近年来，对石油污染物的控制已成为环境保护的重要问题［7］。因此，以环保和健康为宗旨清洁这些石油污染是非常必要的，广大学者已研究并总结出一系列治理污染的技术［8］。相比于物理和化学的修复方法，生物处理是一种费用低、操作简单、环境友好的处理方法［9-10］，不会对环境产生有害影响。但由于微生物修复的效率普遍较低，严重阻碍了微生物修复技术的实际应用，同时，降解石油污染的过程复杂多样，不同菌株对原油的降解效果也各有差异，不同的环境条件和菌株间的相互作用也会影响原油的降解效果［11-12］。本文主要针对陕西定边油田附近石油污染土壤的修复构建高效的混合菌群，分析了它们的降解能力和降解过程中菌剂的组合配比，找寻提高它们降解能力的方法，为后续工程实践提供理论基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

含菌土壤：挖掘陕西定边与靖边油田附近的原油污染土壤表层10数20 cm的土壤，经自然风干，破碎研磨、混匀、过0.85 mm 筛后密封，用于降解菌的分离与富集。

营养原油培养基：将4.8 g K2HPO4·3H2O、1 g（NH4）2SO4、1.5 g KH2PO4、0.2 g MgSO4·7H2O，0.5 g Na3C6H5O7·2H2O、0.1 g酵母粉和0.002 g CaCl2·2H2O 逐一加入超纯水中进行溶解，定容到1000 mL，用2 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液调节pH 为7.0数7.2，制成营养培养基。取营养培养基100 mL，定量加入0.2 g原油（含饱和烃81.58%、芳香烃7.86%、胶质7.26%、沥青质1.06%，回收率97.76%），将培养基置于121℃下高压灭菌25 min。

LB 培养基：将10 g 蛋白胨、10 g NaCl 和5 g 酵母浸粉加入1000 mL的超纯水中进行溶解，制备LB培养基。

DNP-9272A型恒温培养箱，常州恒隆仪器有限公司；LDZX-30KBS 型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；OIL-460型红外分光测油仪，北京华夏科创仪器技术有限公司；JYW-200A 型表面张力测定仪，承德金和仪器制造有限公司；SPX-150 GH型隔水培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石油降解菌株的筛选与分离

将2.0 g预处理后的含菌土样加入100 mL的含2 g/L 原油的营养原油培养基中，在150 r/min、30℃的恒温震荡培养箱培养24 h，转移到另一个新鲜营养原油培养基中振荡富集培养7 d，重复4次。使用稀释涂布平板法培养单个菌落，培养2数4 d 左右，挑取菌落特征明显的单一菌落进行编号保存。

1.2.2 生理生化特性鉴定及分子生物学鉴定

根据文献［13-14］提供的方法对已保存菌株进行生理生化和形貌的分析鉴定。对纯化的细菌进行16S rDNA 的聚合酶链反应扩增，建立和表征不同种属的细菌种类。利用通用引物为模板对菌株 进行16S rRNA 基因的扩增，通用引物为［15］：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492 R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。

具体反应体系为：Template（基因组DNA 20数50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mM）1 μL，酶0.2 μL，F（10 uM）0.5 μL，R（10 uM）0.5 μL，加双蒸H2O 至25 μL，总反应体系共30.2 uL。PCR 扩增条件为：预变性94℃4 min；30 cycle 94℃45 sec，55℃45 sec，72℃1 min；72℃延伸10 min。将扩增产物进行测序并在NCBI进行比对分析，并构建系统发育树。

1.2.3 菌株的生长特性分析

向12 支试管中分别加入5 mL 的LB 液体培养基，在121℃下灭菌30 min，使用接种环接种筛选的石油降解菌（600 nm波长处的吸光度值OD600=0.5），并标注编号，放入恒温振荡培养箱在35℃、180 r/min条件下培养，每6 h取样1次，使用可见分光光度法测定吸光度值，并求出OD600值［16］。使用原油培养基探究菌株以石油为碳源情况下的生长状况，由于培养基中原油在6 h 左右会被细菌乳化，故不能采用分光光度法测量细菌的OD600值，选用平板涂布法［17］测定不同时间下的菌数。

1.2.4 原油降解率的测定

在100 mL 的原油培养基中加入0.2 g 原油，灭菌后继续加入3%接种量的纯化菌液（OD600=0.6），并设置2个平行样和空白对照，在37℃、180 r/min的恒温震荡培养箱中振荡培养7 d 后，使用四氯化碳萃取剩余的原油，使用红外测油仪测定剩余的总石油烃的量。利用所测数据按照式（1）计算原油降解率：

其中，ν—原油降解率；c1—无菌对照样品中原油的总烃类含量，mg/L；c2—接菌样品中原油的总烃类含量，mg/L。

1.2.5 单菌降解残余烃类组成分析

用CH2Cl2萃取细菌降解7 d 后的原油培养基，使用无水Na2SO4除去萃取液中残余水分后进行GC-MS分析。GC-MS分析条件：色谱柱为DB-5MS毛细管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度250℃，载气为高纯度He气，流速1 mL/min；在80℃下保持5 min，然后以6℃/min升温速率升至180℃，保持2 min，再以10℃/min 的升温速率升至300℃，保持10 min；分流比为10∶1。

1.2.6 复配菌株对原油降解效果分析

如表1所示，采用A-3、D-5、C-2这3株原油降解菌株进行正交试验，培养基中原油浓度为2 g/L，在温度35℃、摇床转速180 r/min 下降解反应7 d。通过正交试验和SPSS 主体间效应分析，探究复合菌加量对原油降解率的影响，找到最佳复配比例。

表1 正交实验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离与鉴定

菌株经过多次的转接、筛选、纯化后，分离出5株对原油降解作用明显且活性较高的石油降解菌D-5、C-2、A-3、D-3、D-1，其生理生化特性如表2 所示。使用MEGA7 软件对A-3、D-5、C-2 的基因序列进行系统发育树构建，结果如图1所示。

2.2 菌株的生长状况

分离的不动杆菌D-5、无色杆菌C-2、铜绿假单胞菌A-3、黏质沙雷氏菌属D-3、纤维单胞菌D-1 在LB培养基的生长曲线如图2所示。分离的5种菌株生长状况各有差异，其中A-3、C-2的生长状况最好，对数期菌株增长较快，A-3、C-2和D-5分别在25、30和30 h 左右达到稳定期。A-3、C-2、D-5 以1∶1∶1 的投加量混合的混合菌群E 在LB 培养基的生长曲线也见图2。混合菌E呈现S型增长趋势，细菌生长量也达到较高水平，在LB 培养基中45 h 时OD600值达到1.94，在原油培养基中菌数达到4.3×1015个/mL。Cornforth D M等［18］研究表明，当混合菌生长曲线为S 型增长时，菌株之间将不存在拮抗作用。因此可以将A-3、C-2、D-5这3株细菌作为混合菌降解石油污染物。D-3、D-1 的生长量较低，这可能是由于培养基本身不适合该细菌的生长繁殖。张东升等［19］研究认为，细菌在不同培养基中的适应能力和生长状况各有不同，有些培养基还会抑制微生物自身生长代谢，降低微生物活性。分离的D-5、C-2、A-3、D-3、D-1 等5 种菌株和A-3、C-2、D-5 以1∶1∶1 的投加量混合的菌混合菌群E在原油培养基中的生长曲线如图3所示。混合菌群E在培养基中依然表现出较高的细菌生长量，D-5、A-3 也呈现较好增长的趋势，C-2 相比于D-3、A-1 生长趋势也较好。综合可得，A-3、C-2、D-5 这3 株细菌无论是在独立条件还是混合条件下，在原油中均表现出很高的生物活性，可以用作治理石油污染的修复菌剂。

表2 分离菌株形态与生理生化鉴定

图1 菌株16S rDNA基因序列发育树

图2 菌株在LB培养基中的生长曲线

图3 菌株在原油培养基中的生长曲线

2.3 细菌对原油的降解效果

细菌D-5、C-2、A-3、D-1和混合菌群E对原油的降解率如图4所示。由图4可见，D-5和A-3对原油的降解效率均达到60%以上，C-2 对原油的降解率也达到39.36%。D-3由于降解过程中会将水中分散的原油聚集成为不溶于水和有机溶剂的团状物质，无法使用红外测油仪测定降解率，夹出水中团块物质后水中含油量几乎为0。分析可能是细菌自身分泌的一些胞外物质对原油产生了聚集包覆作用［20］。混合菌群E 对石油的降解率最高，可能是微生物之间的协同作用改善了原油的疏水性和乳化性，增强了微生物对原油的利用效率［21］，具体情况有待进一步研究。结合图3 可知，混合菌在相同培养环境下的生长量比其它菌株的略高，也反映出微生物对石油的利用率增强。

图4 各菌株7 d后对原油的降解率

2.4 残烃的GC-MS分析

单菌（OD600=0.6）和混合菌E 在2 g/L 石油含量的无机盐培养基中反应7 d 后，萃取剩余油相进行GC-MS 分析，结果如图5 所示。由图5 可知，A-3、D-5 和混合菌E 可以高效地降解原油组分中的C16、C17、C18、C19、C21、C44等烃类，且都表现出较强的石油降解能力；而D-1、C-2降解石油组分的能力相对较低。

2.5 菌株的乳化能力和表面活性剂对菌株降解能力的影响

筛选产表面活性剂菌株的方法较多，不同菌株分泌的表面活性剂种类不同，单一方法不能准确测定菌株分泌表面活性剂的能力［22-23］。表3 为血平板乳化实验和菌株降解后培养液表面张力的测定结果。将5种菌株接种到血平板上，在20℃下经过2 d的恒温培养，只有A-3、D-5 生成了大小不同的透明乳化圈，且发酵液的表面张力的差异不大。可能是由于血平板培养基不能很好地促进菌株生成表面活性剂。其他3 种菌株均未产生透明的乳化圈，发酵液表面张力基本接近空白培养基的表面张力，因此菌株对培养基中原油的降解率低［24］。

图5 各菌株降解原油后剩余组分的GC-MS分析

向培养基中加入4 mL的质量浓度为10 g/L的表面活性剂Tween 80，降解反应7 d后单菌对原油的降解率如表4所示。结果表明，向培养基中加入表面活性剂Tween 80后，5株细菌对原油的降解率均有所提高，其中C-2对原油的降解率提升最高，达到70.84%。

表3 各菌株分泌表面活性剂的能力

表4 各菌株在有Tween80的情况下对原油的降解率

2.6 高效降解菌群的复配

不同菌株降解原油中各组分物质的效率和方式存在差异，菌株之间也会相互影响，当菌株之间相容性较高或存在协同关系时，混合菌群能发挥最大的降解作用。研究表明，混合菌株投加比例合适时，会进一步提高细菌的降解效率［25-26］。D-5、C-2和A-3按不同比例混合的混合菌对原油的降解率见表5，SPSS主体间效应的检验结果分析见表6。由表5可知，混合菌群在D-5、C-2 和A-3 之间的最佳接种比例5∶1∶5时对石油的降解效果最好。结合表6主体间效应检验结果的Sig 值（0.05＜D-5＜A-3＜C-2，即0.05＜0.129＜0.354＜0.502）来看，3株菌对原油降解率均不产生显著性影响，但混合菌群能有效地降解原油，说明各菌群对石油的降解均起到一定作用，其中D-5 对石油污染物的降解效果影响最大，其次是A-3、C-2。通过实验发现，在最佳条件（温度35℃、pH 7.5、摇床转速180 r/min、菌液加量6 mL）下，最佳接种比例的混合菌群在原油培养基中对原油的降解率达到74.18%。

表5 菌株复配正交试验与极差分析

表6 SPSS主体间效应的检验结果分析

2.7 Tween80加量对菌株降解能力的影响

通过以上探究发现，加入Tween80 可以明显提升菌株对原油降解能力。表面活性剂对原油有较强的乳化作用，适量加入会提高微生物自身的活性，增强对原油的降解，但加入过量的表面活性剂会对微生物产生毒害作用［27］。研究表明［28-29］，投加的表面活性剂未达到临界胶束浓度cmc 前，疏水性有机化合物的溶解性不能得到显著提升。通过“拉环法”测定了加有不同量的Tween80 原油培养基的表面张力，结果见图6。经测Tween80 在原油培养基中的cmc值为30 mg/L，此时培养基的表面张力趋于稳定。为了进一步提高复配菌株对原油的降解效率，考察了不同Tween 80加量下复配菌株对原油的降解速率，结果见图7。当培养基中Tween 80 加量为30 mg/L（1 cmc）时，降解7 d后混合菌群对原油的降解效果低于未添加Tween 80的，当Tween 80加量为150 mg/L（5 cmc）时，降解7 d 后混合菌群对原油的降解效果高于未添加Tween 80的，降解率达到了87.12%，能很好地应用于石油污染的修复。

图6 Tween80在培养基中的cmc值测定

图7 Tween80加量对菌群降解效果影响

3 结论

从陕北定边、靖边油田原油污染土壤中筛选的原油降解菌中不动杆菌D-5、无色杆菌C-2、铜绿假单胞菌A-3对原油的降解率分别为61.46%、39.36%和62.42%，其中，D-5、A-3 可降解原油中大分子烃类，降解作用明显，C-2 的生物活性高，与菌株A-3、D-5 有较好的相容性，在表面活性剂作用下降解效果显著。将这3 种菌株进行复配，复配后的混合菌在LB 培养基中45 h 时OD600值达到1.94，在原油培养基中菌数达到4.3×1015个/mL，比单菌数量有所提升。在温度为35℃、pH 为7.5、摇床转速为180 r/min、复配菌剂加量比D-5∶C-2∶A-3 为5∶1∶5、加量为6%、表面活性剂Tween80 浓度为150 mg/L 时，混合菌的降解效果可达到87.12%，能很好地应用于石油污染的修复。