金花茶花粉离体萌发及低温处理探究

张佩霞，于波，陈金峰，赵超艺，邹春萍，孙映波

(广东省农业科学院 环境园艺研究所，广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东　广州510640)



金花茶花粉离体萌发及低温处理探究

张佩霞，于波，陈金峰，赵超艺，邹春萍，孙映波

(广东省农业科学院 环境园艺研究所，广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东广州510640)

摘要：研究了硼酸及蔗糖浓度、培养时间、含水率、低温对金花茶花粉离体萌发的影响。结果表明，硼酸及蔗糖浓度对花粉萌发均有显著影响，当硼酸浓度0.1g/L和蔗糖浓度100g/L时，花粉萌发率最高；25℃培养24h后花粉充分萌发；花粉含水率为70.39%和52.67%时，低温处理导致花粉活力降低，甚至丧失，不利于花粉低温保存。含水率为39.89%和30.90%时，花粉低温处理后的萌发相对保持率均维持在86%以上；含水率39.89%的花粉出现“冷刺激”现象，低温处理后萌发率回升，新鲜花粉低温保存前进行适当干燥处理有利于萌发。研究结果将为金花茶种苗繁育提供参考。

关键词：金花茶；花粉；离体萌发；硼酸；蔗糖；含水率；低温处理

金花茶(Camellianitidissima)为山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)常绿灌木或小乔木，以山茶家族中唯一具有金黄色花瓣的品种，而闻名于世，享有“茶族皇后”、“植物界大熊猫”之美誉，是中国一级珍稀濒危保护植物[1～2]。

金花茶在园林观赏方面具较高价值，属珍贵稀有观赏植物。与其他山茶族茶花品种相比，金花茶花瓣金黄、蜡质、肥厚，晶莹剔透，较为罕见，可堪称世界花坛之尊[3]。此外，金花茶还具有药用保健价值[4]。在茶花育种界，金花茶是培育黄色花系茶花新品种的宝贵育种材料，许多科研工作者如著名园艺学家陈俊愉、程金水教授等对其杂交育种做了大量研究工作[5～6]，金花茶花粉活力越高，杂交授粉越容易成功。在金花茶育种过程如何保存花粉，使其保持较高活力，是杂交成功的核心问题。常温条件花粉一般只能保存3-5d，通过低温贮藏可以延长花粉保存时间，可解决不同品种茶花之间杂交花期不遇问题。

关于茶花品种花粉活力的测定及低温贮藏的研究已有报道[7～8]，但对于金花茶花粉的研究非常少，金花茶花粉含水率对花粉低温保存的影响则更少，许多花粉贮藏研究缺乏对花粉含水率的测定[9～10]，而花粉含水率是影响花粉低温保存的主要因素，如果花粉含水率过高，低温冷冻会严重破坏花粉活力[11]，只有适量的含水率才有利于长期低温保存花粉。因此，本试验探究了金花茶花粉离体萌发的适宜培养基成分浓度、不同培养时间花粉萌发率及花粉含水率对其低温保存的影响，以更好地保存金花茶花粉，为茶花新品种培育提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

试验选用广东省农业科学院环境园艺所茶花资源圃内的普通金花茶品种，金花茶植株生长健壮，无病害。2015年1月30-31日上午采集花粉，使用毛刷将金花茶花粉收集于硫酸纸袋，及时带回实验室供试。

1.2试验方法

1.2.1花粉萌发率测定

试验在广东省农业科学院环境园艺所重点实验室进行，采用固体培养基离体培养法进行花粉萌发试验。先用解剖针挑取少量花粉放入装有培养液(固体培养基不加凝固剂)的加样试管中，充分摇匀，用加样器吸取花粉液放于玻璃培养皿，培养皿内有一层厚度0.5mm左右固体培养基，使花粉液均匀布满固体培养基表层，25℃全光照培养。运用体视显微镜观察花粉萌发情况，试验设置3次重复，每个重复随机观察3个视野，每个视野统计大于100粒花粉，花粉管长度大于花粉直径的花粉视为萌发花粉。

花粉萌发率(%)=(萌发花粉数/观察花粉总数)×100%。

1.2.2花粉含水率的测定

新鲜花粉含水率70%左右，将花粉保存在硫酸纸袋，放于盛有硅胶干燥剂的玻璃皿内，室内进行干燥。花粉含水率测定采用烘干法。将称量瓶放入130℃烘箱中烘至恒重，称量数据为W1，然后瓶内加入0.1～0.2g花粉，称重数据W2，将其放入烘箱，130℃烘1-2h，直至恒重，冷却称重，数据为W3，相对含水率=(W2-W3)/(W2-W1)×100%，试验设置3次重复，平均值为其相对含水率。

1.2.3蔗糖和硼酸浓度对花粉萌发率的影响

固体培养基的基本成分为10g/L琼脂，再在基本成分中添加0.1g/L、0.2g/L和0.3g/L的硼酸及100g/L、150g/L和200g/L的蔗糖，组合形成9种培养基，培养基pH值6.0，试验设计具体处理见表1。在25℃恒温培养条件下培养3h，观察花粉萌发情况，确定最佳培养基质，花粉培养操作步骤及统计方法同1.2.1。

1.2.4培养时间对花粉萌发的影响

选取4种不同含水率金花茶花粉，25℃恒温培养条件下分别培养3h、24h、48h，观察花粉萌发率，确定花粉培养观察时间。

1.2.5低温处理对花粉萌发的影响

选择适宜的培养基质和萌发时间后，取4种不同含水率金花茶花粉，常温25℃条件对花粉活力进行测定，再将花粉分别放于4℃、-40℃、-80℃冰箱，低温处理3d，解冻后观察花粉萌发情况。花粉萌发相对保持率的计算方法：

相对保持率(%)=(低温冷冻后萌发率/低温冷冻前萌发率)×100%。

1.3数据分析

采用SPSS 19.0软件的最小显著性差异法(LSD)进行方差分析(ANOVA)。

2结果与分析

2.1蔗糖和硼酸浓度对花粉萌发的影响

金花茶花粉在试验中的9种培养基上萌发率为10.63%～48.35%，萌发率LSD多重检验结果表明，萌发率之间差异显著(表1)。硼酸及蔗糖浓度两因素方差分析结果显示(LSD法，=0.05)，硼酸对花粉萌发作用呈显著性差异(P=0.040<0.05)；蔗糖对花粉萌发作用呈显著性差异(P=0.043<0.05)。硼酸浓度0.1g/L时，花粉萌发率最高，说明低浓度的硼酸利于金花茶花粉的萌发，浓度过高会抑制其萌发。蔗糖浓度对花粉萌发的影响也显著，在硼酸浓度相同蔗糖浓度100g/L时，金花茶花粉萌发率最高，说明金花茶萌发不需要高浓度蔗糖，低浓度蔗糖利于其萌发。因此，当硼酸浓度0.1g/L，蔗糖浓度100g/L时，最利于金花茶花粉萌发，可作为金花茶花粉萌发的基本培养基。

表1　不同培养基花粉萌发率

注：表中a、b、c、d、e、f为不同处理间LSD多重检验结果(=0.05)。

2.2培养时间对花粉萌发的影响

取含水率分别为70.39%、52.67%、39.89%和30.90%的金花茶花粉，25℃温度条件下进行离体萌发培养，培养基质采用2.1中最佳培养基，培养3h、24h、48h后观察统计萌发率。花粉培养3h萌发率分别是57.39%、49.37%、50.15%和22.67%；花粉培养24h萌发率依次是73.85%、73.54%、67.46%和23.15%；花粉培养48h后，花粉管萌发较长，且相互叠加，体视显微镜条件下萌发率难以观察统计。

花粉离体培养24h与3h相比，萌发率分别提高28.68%、48.96%、34.52%和2.12%，说明离体培养3h，花粉未充分萌发；离体培养48h，花粉管萌发过长，相互叠加影响观察，不利于萌发率统计；离体培养24h，花粉萌发充分，并能清晰统计萌发率，适宜作为花粉萌发率统计的时间点。

2.3低温处理对不同含水率花粉萌发的影响

将4种不同含水率的金花茶花粉低温处理3d，检测花粉萌发率，培养基采用2.1中最佳培养基，培养时间24h，其中以常温25℃条件金花茶花粉萌发率为基准，计算3种低温处理后花粉萌发的相对保持率(表2)。对试验中含水率及温度两因素进行方差分析(LSD法，=0.05)，结果表明，金花茶花粉含水率对花粉萌发作用呈显著性差异(P=0.03<0.05)；低温处理作用的差异性不显著(P=0.2>0.05)，说明金花茶花粉含水率是影响其花粉萌发率的关键因素。

当金花茶花粉含水率高达70.39%时，常温萌发率高达73.85%，经过4℃、-40℃和-80℃低温处理，其花粉萌发率分别降低至22.15%、5.23%和2.19%，相对保持率最低，严重影响到花粉活力。花粉含水率52.67%时，4℃、-40℃处理后，花粉相对保持率均在92%以上；-80℃处理时，相对保持率仅为6.35%。说明含水率较高时，-80℃低温会对花粉活力造成伤害。花粉含水率39.89%时，花粉经过低温处理，花粉萌发率较常温状态均出现升高，4℃、-40℃、-80℃低温处理后，花粉活力相对保持率最佳，分别为107.60%、103.99%和102.62%，低温处理促进花粉萌发，即出现“冷刺激”现象，可能是保护酶参与了花粉对低温胁迫的生理生化反应，具体机理需要进一步探究。花粉含水率30.9%时，低温处理后，花粉相对保持率均在86%以上。

表2　不同含水率花粉在不同温度处理下的萌发率

注：表中a、b、c、d为不同含水率间LSD多重检验结果(=0.05)。

3结论与讨论

金花茶是培育黄色茶花的优良育种材料。常规杂交育种过程，常出现花期不遇，所以要对花粉进行低温保存。低温贮藏后会影响花粉活力，这是限制杂交育种的一个重要问题，唯有高活力花粉，才能保证杂交成功[12]。因此，如何使花粉经过低温保存后仍保持较高活力，在品种培育中极为关键。

花粉离体培养是测定花粉活力的常用方法，操作简单，结果准确。本文采用9种固体培养基，用于金花茶花粉离体培养。硼酸和蔗糖浓度对金花茶花粉萌发率均有显著影响，低浓度硼酸有利于花粉萌发，浓度过高会抑制其萌发，同样高浓度蔗糖也不利用花粉萌发，这与谢焰锋、张涛等的研究结果一致，也认为高浓度蔗糖对金花茶花粉萌发有一定抑制作用[13～14]。硼酸浓度为0.1g/L和蔗糖浓度为100g/L，可作为金花茶花粉离体萌发最佳培养基。

虽然金花茶新鲜花粉具有较高活力，萌发率可达73.85%，但含水率在低温处理前较高时，冷冻后难以保持其活力，必须进行适当干燥处理。当金花茶含水率在30.9%～39.89%范围时，花粉低温处理后，萌发相对保持率均维持在86%以上，可作为金花茶花粉低温保存含水率的参考依据。金花茶花粉含水率在52.67%～70.39%范围时，低温后导致花粉活力降低，甚至丧失，不利于金花茶花粉低温保存。金花茶花粉含水率对低温处理后花粉活力有显著影响，耿兴敏等在研究唐菖蒲花粉低温保存时，也发现含水率对花粉保存效果影响显著[11]。

金花茶花粉25℃温度条件离体培养，培养24h后萌发率较高，相较于3h培养时间，花粉得以充分萌发；相较于48h培养时间，花粉管萌发不会过长，利于显微镜下萌发率观察统计，因此，24h培养时间适宜作为金花茶花粉离体萌发率的统计时间点。

金花茶花粉低温处理，活力均升高，出现“冷刺激”现象，这种现象在牡丹花粉、茶花‘桂叶金心’花粉等研究中也有报道[7,15]。原因可能是酶在低温条件下受到抑制，冷热交替刺激酶活性恢复，使得花粉萌发率升高，具体机理还有待深入研究[16]。

许多花粉低温保存的研究，主要是针对培养基成分及浓度和保存温度的研究[16～20]，缺乏对花粉含水率的研究，而花粉含水率对低温保存有显著影响，直接关系到花粉保存后的活力及保存期限，因此在研究花粉低温保存时，有必要加强对花粉含水率的测定。

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Pollen Germination and Low Temperature Treatments of Camellia nitidissima

ZHANG Pei-xia, YU Bo,CHEN Jin-feng, ZHAO Chao-yi, ZOU Chun-ping, SUN Ying-bo

(Environmental Horticulture Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangdong Provincial Key Laboratory of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Guangzhou Guangdong 510640, P.R.China)

Abstract:The effect of concentration, culture time, water contents and low temperature of boric acid and sucrose on in vitro pollen germination of Camellia nitidissima were studied.The results showed that boric acid and sucrose were significantly affected the pollen germination.When the concentrations of boric acid and sucrose were 0.1g/L, and 100g/L respectively, the pollen germination rate reached the highest.The pollens fully germinated when they were cultured at 25℃for 24 hours.The active ability of pollen would be reduced or even loss when the pollen treated by low temperature with water content rate of 70.39% and 52.67%.The germination relative retention rates of pollens remained above 86% when water contents rate were 39.89% and 30.90% with low temperature treatment.The germination rate of pollen with water content rate of 39.89% recovered at low temperature treatment，which is known as “cold stimulation” phenomenon.It is good for fresh pollen germination if it was dried properly before low temperature preservation.

Key words:Camellia nitidissima;pollen;in vitro germination;boric acid；sucrose；water content rate;low temperature treatment

中图分类号：S 792.39

文献标识码：A

文章编号：1672-8246(2016)02-0094-04

通讯作者简介：孙映波(1964-)，男，副研究员，主要从事园林植物培育研究。E-mail：sunyingbo20@163.com

第一作者简介：张佩霞(1985-)，女，硕士，助理研究员，主要从事园林植物应用研究。E-mail：agreenchild@163.com

基金项目：茶花资源创新利用与示范平台建设(2014B070706016)，花卉育种与开花调控技术研究(2011A020102007)，花卉创新团队岗位专家及综合示范与培训站长建设任务(粤财教[2014]371号)。

*收稿日期：2015-07-13