丽江油橄榄品种表型及SSR标记的多样性及聚类分析

耿树香，杨生超，宁德鲁，李勇杰

(1.云南农业大学 农学与生物技术学院,云南 昆明 650201；2.云南省林业科学院,云南 昆明 650201)

油橄榄(OleaeuropaeaL.)是世界著名的优质木本油料树种，主要为异花授粉植物，为二倍体植物(2n=46)，全基因组约为2 200Mb。在长期引种驯化和人工选择过程中，形成了遗传变异丰富并具有优良性状的油橄榄品种，对这些品种的正确鉴定和特异性状的鉴别，了解品种间遗传变异和多样性，是油橄榄品种资源利用和育种工作的重要前提[1-3]。油橄榄的栽培历史悠久，种质资源丰富，其中包含大量的野生种、半野生种和栽培种，而且不同地域间品种交换频繁，导致同名异物或同物异名的现象十分普遍。油橄榄品种繁多，据统计：世界各地油橄榄自产品种共计1 275个，中国现有登记品种共158个[4]。在油橄榄长期引种驯化及人工栽培过程中，形成了遗传变异丰富并具有优良性状的油橄榄品种，对现云南丽江引种的油橄榄品种进行正确鉴定及特异性状的鉴别，势在必行。

早先对油橄榄品种的鉴定都基于表型及农艺性状[5-6]。近年来，国外已有一些采用RAPD、AFLP、SSR和ISSR等分子标记技术进行油橄榄品种鉴定和遗传多样性研究的报道[7-14]。虽然利用分子标记可以准确鉴定油橄榄品种并了解其遗传信息，但难以与表型性状相结合，缺乏分子标记与表型性状的验证分析。本研究利用已成熟的SSR分子标记技术，对收集保存丽江大具的19份油橄榄种质(育成品种、地方种质)进行表型性状及遗传分析，从DNA水平评估遗传多样性，并进一步探究云南引种油橄榄种质资源品种间的亲缘关系，为今后的遗传育种提供可靠的遗传背景信息。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料采集于云南省丽江市金沙江低山河谷地带，24°16′N，100°04′E，海拔1 766m，砂壤。拥有独特的光热、土壤等自然条件，具备优越的油橄榄生长环境。年平均气温14-18℃，极端最低温度-7℃至-9℃，平均年降雨量500-1 000mm，平均相对湿度61%-69%，日照2 000-2 700h。于2017-2018年连续进行了表型性状的测定。材料编号、名称、起源和用途见表1。

表1 油橄榄品种及其原产地

1.2 油橄榄表型性状的测定

每个品种从树冠南侧齐肩高处，选取树龄5年，一年生枝条8-10根，在枝条中部共取40片正常叶，参照国际植物新品种保护联盟(UPOV)的《植物新品种DUS测试指南 油橄榄》TG/99/3 1985-11-13的相关标准测定叶片长度、叶片宽度、叶形指数、叶片厚度、叶周长共5个性状指标，其中叶形状由叶形指数叶片长度(L)/叶片宽度(W)来确定：L/W<4为椭圆形；L/W=4-6为椭圆披针形；L/W>6为披针形。在果实成熟期，每株从同一部位最具代表性的结果枝的中部，选取发育正常并完成转色的果共计40粒，测定果横径、果纵径、单果重、果形状、果肉率、果形指数共6个性状指标，其中果形状由果形指数果实长度(L)/果实宽度(W)来确定：L/W<1.25为球形；L/W=1.25-1.45为卵形；L/W>1.45为细长形。剥去果肉后，将果核洗净、晾干，测定果核横径、核纵径、单核重、核形指数、核形状共5个表型性状指标，其中核形状由核形指数核纵径(L)/核横径(W)来确定：L/W<1.4为球形；L/W=1.4-1.8为卵圆形；L/W=1.8-2.2为椭圆形；L/W>2.2为细长形。

1.3 SSR标记

2017年春季采集一年生枝条顶端幼嫩叶片，用植物基因组提取试剂盒(Tsingke生产，货号TSP101-200)提取基因组DNA。从已发表的SSR引物中筛选出能在19个样品中稳定扩增、多态性好的20对SSR引物(UDO99-001、UDO99-004、UDO99-012、UDO99-014、UDO99-015、GAPU59、DCA04、DCA09、DCA11、DCA16、DCA18、EMO02、EMO30、EMO90、GAPU59、GAPU71B、GAPU89、GAPU101、UDO24、UDO36)用于遗传分析[15-16]。反应体系15μL，扩增程序94℃预变性5min；94℃预变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸5min；4℃保存。扩增结束后，吸取2μLPCR产物，加入6μL 1×loading buffer(Tsingke生产，货号TSJ010)混匀，0.8%琼脂糖凝胶(电压：5V/cm，EB染色)电泳10-15min分离，电泳液缓冲液0.5×TBE。电泳结束后，凝胶成像仪紫外成像留影。

1.4 数据统计与遗传分析

位点信息汇总在一个Excel表中，按照CONVERT 131软件要求格式整理，转换格式。用PopGene 32软件计算各标记的主要等位基因频率、观察等位基因数(na*)、有效等位基因数(ne*)、Shannon’s多样性指数、期望杂合度(Nei**)和观望杂合度。利用Population软件计算遗传距离因子，用邻接法(NJ)绘制进化树。

2 结果与分析

2.1 19个油橄榄品种表型性状评价

不同油橄榄品种的表型数量性状变异丰富，其变异系数为7.6%-51.85%，所测的19个油橄榄品种中，果实2个球形，7个卵形，10个细长，大多品种皮孔较少；叶2个披针形，1个椭圆形，其余16个均为椭圆披针形，19个品种油橄榄叶片有一个向上，18个叶片纵向平展。

表2 油橄榄14个表型数量性状统计分析

基于14个表型数量性状计算品种间的Eudidean距离，对19个油橄榄品种的NJ聚类分析结果(图1)表明，19个油橄榄品种聚为2个组，其中第1大组又包括3个小组，第1大组的第1小组包括佛奥、皮瓜尔、贝拉、城固、阿斯；第2小组包括柯基、豆果、米扎、阿波萨纳、云杂；第3小组组包括皮削利、莱星、科拉蒂、鄂植8号、卡林、配多灵、坦彩、小苹果；第2大组为白橄榄。

图1 油橄榄数量性状分析聚类图

2.2 基于油橄榄SSR标记的多样性及聚类分析

20个SSR位点在19个品种中的检测结果(表3)，共检测到124个等位基因变异，平均每个等位基因数为6.2个。其中DCA09、UDO24位点产生10个等位基因变异，UDO99-001、UDO99-004产生3个等位基因变异，最大等位基因频率为0.631 6，多态信息量平均为0.646 4，Shannon’s指数H’平均为0.693 3，Shannon’s指数H’范围在0.513 9-0.831 8之间，表现出丰富的遗传多样性。

根据SSR标记计算品种间的Jaccard系数，对19个油橄榄品种的NJ聚类分析结果(图2)表明，19个油橄榄品种被分成3组，第1组包括阿波萨纳、豆果、卡林；第2组包含坦彩、城固、贝拉等15个油橄榄品种；第3组为米扎。

表3 20对SSR引物的多态性分析

图2 SSR标记油橄榄聚类分析的无根NJ树状图

3 结论与讨论

本研究对云南丽江引种的19个油橄榄品种14个表型性状和20个SSR标记的多样性分析表明，19个油橄榄品种具有较丰富的表型及遗传多样性，在本研究中选用的20对引物可完全把19个油橄榄品种区分开。表型性状相似的品种需结合SSR标记进一步结合鉴定。

19个油橄榄品种叶片表型数量性状(除叶型指数和叶厚)在品种内具有较大的差异，这说明叶片表型性状是不稳定的。本文并未对表型数量性状进行多年分析比较，但叶片的大小和形态会随着树龄而变化，果实和果核的大小在“大小年”也存在很大的差异，所以表型数量性状仅能作为品种鉴定的参考。此外，数量性状与丰产性、抗性和“童期”长短相关，可以作为实生选优早期鉴定的依据。

19个油橄榄品种表型性状和SSR分子标记具有较丰富的遗传多样性，其表型性状变异系数具有一定的差异性，表型性状相似的品种，其不一定具有亲缘关系，所以表型性状在聚类分析上应结合SSR标记进行油橄榄品种的鉴定。