镉胁迫对三叶草种子形态指标、光合色素含量及酶活性的影响

董春燕

(青州市亚泰农业科技有限公司，山东 青州 262500)

镉(Cd)是植物非必需的重金属元素，具有移动性强和生物毒性大的特点，易被植物吸收[1]，并对植物的生长发育造成不利影响，如降低叶片光合性能、抑制植物代谢进程、改变植物体内酶的催化功能和破坏活性氧的代谢平衡，进而引起植株早衰甚至死亡[2]。近年来，随着工矿业的迅猛发展及各类化学药品的广泛施用，土壤镉污染程度加剧，给农业生产和人类的身体健康带来严重危害，从而引起了社会各界的广泛关注。当前，有关镉胁迫在长春花[Catharanthusroseus(L.)G. Don][3]、圆叶决明[Chamaecristarotundifolia(Pers.)Greene][4]、紫苏[Perillafrutescens(L.)Britt.][5]、车轴草(TrifoliumLinn.)[6]等作物上已有众多研究报道，而在三叶草上研究主要集中在镉在三叶草体内的富集特性[7]，而有关镉对三叶草种子萌发、幼苗生长及保护酶活性等方面的研究未见报道。本试验采用水培试验,研究了镉单一胁迫对三叶草(TrifoliumpretenseL.)种子萌发、幼苗生长、光合色素含量及保护酶系统的影响,旨在探明三叶草对镉的忍受范围，并探寻镉对三叶草的毒害机理，以期为三叶草镉胁迫机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

三叶草种子由山东农业工程学院实验基地提供。在济南工程学院试验基地采集同一繁殖系内形态指标基本一致、无病虫害的三叶草幼苗。

1.2 方法

1.2.1 三叶草种子萌发试验

通过在1/2Hoagland溶液中添加Cd(NO3)2配制成镉浓度分别为0mmol/L、0.5mmol/L、1.5mmol/L、2.5mmol/L和3.5mmol/L的溶液。选择饱满的三叶草种子，用0.1%的升汞进行表面消毒4min，蒸馏水反复冲洗后均匀播种到铺有2层消毒纱布的培养皿中，每皿50粒。用镉浓度分别为0mmol/L、0.5mmol/L、1.5mmol/L、2.5mmol/L和3.5mmol/L的1/2Hoagland溶液浸种，每天更换1次1/2Hoagland溶液，每处理3次重复。浸种后放置于温度22-25℃的光照培养箱中培养，记录每天的发芽情况，处理第7d开始计算发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数，测定苗长、芽长、根长和胚轴长，取平均值。

1.2.2 三叶草水培试验

用自来水冲洗掉叶片及根系上的泥土，移栽到装有1/2Hoagland溶液的塑料箱中，每箱栽植10株，培养5d后，将其溶液更换成含有镉浓度分别为0mmol/L、0.5mmol/L、1.5mmol/L、2.5mmol/L和3.5mmol/L的1/2Hoagland溶液，每处理3次重复，即每处理栽植3个塑料箱的三叶草，每4d更换1次培养液，镉胁迫14d后对三叶草幼苗苗长、芽长、胚轴长、根长、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)进行测定。

1.2.3 测定指标

用游标卡尺测定苗长、芽长、胚轴长和根长。采用分光光度法测定光合色素含量[8]；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性分别采用氮蓝四唑(NBT)还原法、高锰酸钾滴定法和愈创木酚法进行测定[9]；抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性检测参照Nakano和Asada的方法[10]。

1.3 数据处理与分析

发芽率(%)=种子发芽粒数/种子播种粒数×100；发芽势(%)=前3d发芽种子总数/皿中供试种子数×100；发芽指数(GI)=∑Gt/Dt(Gt为t时间种子发芽数，Dt为相应的发芽天数);活力指数(VI)=GI×S(S为苗长)。

使用Microsoft Excel 2003软件对数据图表进行处理，使用DPS 7.02软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 镉胁迫对三叶草种子萌发的影响

由表1可知，不同浓度的镉胁迫对三叶草种子发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数的影响显著。随营养液中镉浓度的增加，发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均呈现逐渐降低的趋势，在镉浓度0.5mmol/L时，上述指标较对照0mmol/L分别降低9.52%、55.00%、17.17%和54.12%；而当在镉浓度3.5mmol/L时，发芽率和发芽指数较对照降低92.75%和93.34%，发芽势和活力指数为0，差异极显著(P<0.01)。由此可见，镉对三叶草种子萌发的抑制程度与其浓度具有正相关关系，至3.5mmol/L时能够完全抑制其萌发。

表1 不同浓度镉胁迫对三叶草种子萌发的影响

注：同列数据后不同小写或大写字母表示5%或1%显著水平，下同。

2.2 镉胁迫对三叶草幼苗生长的影响

由表2可以看出，不同浓度的镉对三叶草幼苗的生长均具有抑制作用，抑制程度随其浓度增加而增加。随镉浓度的增加，三叶草幼苗苗长、芽长、胚轴长和根长逐渐减小，且各处理间差异均达到极显著水平(P<0.01)，在镉浓度0.5mmol/L、1.5mmol/L和2.5mmol/L时上述指标与对照的比值分别为0.55、0.16、0.059，0.70、0.18、0.07，0.71、0.17、0.072，0.36、0.13、0.04，可见镉对三叶草幼苗根的伸长抑制作用最强，苗长次之，芽长和胚轴长相对较小。在镉浓度3.5mmol/L时，苗长、芽长、胚轴长和根长均为0，表明在该浓度下三叶草幼苗生长被完全抑制。

表2 不同浓度镉胁迫对三叶草幼苗生长的影响

2.3 镉胁迫对三叶草幼苗光合色素含量的影响

由图1可知，镉胁迫能够降低三叶草光合色素含量，且随镉浓度的增加呈现逐渐降低的趋势。叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)和类胡箩卜素均随镉浓度(0-3.5mmol/L)的增加表现出类似的变化规律，即随镉胁迫强度的增加而显著减小。在0.5mmol/L时上述指标较对照分别降低41.14%、24.32%、37.64%和21.05%，而当镉3.5mmol/L时上述指标较对照分别降低94.40%、70.27%、89.32%和77.37%，与对照差异达到极显著水平(P<0.01)，表明在该浓度下三叶草叶绿体的结构受到严重破坏。

图1不同浓度镉胁迫对三叶草幼苗光合色素含量的影响

注：同一柱形图不同小写或大写字母表示5%或1%显著水平，下同

Fig.1 Effect of stress on photosynthetic pigments inTrifoliumpretenseL.seedlings

2.4 镉胁迫对三叶草叶片保护酶系统的影响

由图2可知，三叶草叶片的SOD、CAT和POD活性在镉胁迫下其变化趋势相同，均随Cd浓度的增加呈现先升高后降低的趋势。在镉浓度1.5mmol/L时SOD、CAT和POD活性达到最大，极显著高于其他处理(P<0.01),较对照分别增加36.02%、33.53%和93.55%；当镉浓度继续增加，上述指标开始下降，至镉浓度为3.5mmol/L时SOD、CAT活性均低于对照，但二者差异不显著，而POD仍高于对照，且与对照差异亦不显著；这表明在镉浓度0-1.5mmol/L范围内，镉浓度的增大能诱导叶片SOD、CAT和POD活性的提高。APX活性在镉浓度0.5mmol/L时最高，较对照提高80.80%，当镉浓度1.5mmol/L时开始降低，但其活性仍高于对照，当镉浓度至3.5mmol/L时开始低于对照，较对照降低19.44%，差异极显著(P<0.01)。

图2 不同浓度镉胁迫对三叶草叶片保护酶系统的影响

3 结论与讨论

采用水培试验，研究不同浓度的镉胁迫对三叶草种子萌发、幼苗生长、光合色素含量及保护酶系统的影响，以探究三叶草对镉胁迫的敏感性和耐性，对探讨三叶草镉胁迫机制、指导镉胁迫地区的景观绿化设计有重要意义。结果表明：镉能够抑制三叶草种子萌发和幼苗生长，在镉浓度0.5mmol/L时其种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、苗长、芽长、胚轴长和根长被抑制，较对照差异达极显著水平(P<0.01)，镉浓度至3.5mmol/L时发芽势、活力指数和幼苗生长被完全抑制。叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)和类胡萝卜素随镉浓度的增加而降低，与对照对照差异极显著(P<0.01)。在镉浓度 0-1.5mmol/L范围内，保护酶SOD、CAT和POD活性升高，较对照分别提高36.02%、33.53%和93.55%，继续增加镉浓度至2.5mmol/L时酶活性呈下降趋势；APX活性在镉浓度为0.5mmol/L时最高，较对照提高80.80%，继续增加镉浓度其活性开始下降，表明在低浓度镉(0-0.5mmol/L)胁迫下，三叶草幼苗具有较强的抗氧化能力。

种子萌发与幼苗生长状况对作物后期的生长和生物量的积累有直接影响。镉虽然是植物生长过程的非必需元素，但镉胁迫会对种子萌发和幼苗生长产生不同程度的影响。一般认为，镉在低浓度条件下对种子萌发及幼苗生长有积极的刺激作用，而在高浓度条件下产生抑制效应[11]。王新新等[12]研究指出，低浓度的镉对碱蓬[Suaedaglauca(Bunge)Bunge.]种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、幼茎长度和幼茎重量有诱导作用，而高浓度时表现出抑制的特性。王兴明等在进行镉胁迫对油菜(BrassicanapusL.)种子萌发试验研究时也得出类似的结论，即镉胁迫对油菜种子发芽率、发芽势和发芽指数具有低浓度促进高浓度抑制的特性[13]。本试验条件下,当镉浓度达到0.5mmol/L时对三叶草种子萌发和幼苗生长均产生抑制作用，且随着其浓度增加抑制作用增强,表明三叶草对镉较为敏感,这与前人研究结论不尽相同。究其原因,这可能与本试验镉浓度设置较高有关，也可能是不同作物对镉的生理响应存在差异而致，具体原因将在后续试验中进一步探究。镉对三叶草种子萌发和幼苗生长产生抑制的原因可能是其在高浓度条件下能够对种子的胚和芽等产生伤害，同时抑制种子内淀粉酶和蛋白酶的活性，进而制约了种子内淀粉与蛋白质的分解，使种子在萌发时得不到充足的养分供应，最终限制了种子的萌发[14]。

光合色素可作为判断植物光合性能强弱和反映逆境胁迫状况的重要指标之一。叶绿素作为绿色植物主要的光合色素，其含量高低不仅可以在一定程度上反映植株光合能力的强弱，还可以表征在逆境胁迫条件下植物组织和器官的损害程度及衰老状况[15]。吴坤等[16]研究认为，叶绿素和类胡萝卜素含量随镉胁迫浓度具有负相关关系。段瑞军等[17]研究认为，镉浓度低于50mg/kg时对海雀稗(Paspalumvaginatum)叶绿素含量的影响不显著，当镉浓度高于100mg/kg时叶绿素含量显著降低。本试验结果表明，随着镉浓度的增加三叶草光合色素含量显著降低，与前人研究结论类似，这可能是因为镉胁迫刺激了植株体内脱落酸(ABA)合成的增加，而ABA能够反向调节叶绿素a和叶绿素b结合蛋白基因，抑制叶绿素的合成[18]，另外，镉在植株体内的积累能够使叶绿体结构遭到破坏，限制了叶绿素的合成[19]。镉可以诱导植物体活性氧(O2·-和H2O2)的产生和清除失去平衡，引起活性氧的积累，活性氧启动膜脂过氧化使膜结构遭受破坏，细胞功能失常，机体出现各种自由基综合症[20]。SOD、CAT、POD和APX是植物体保护酶系统中清除活性氧的重要酶类[21]。当植物遭受重金属胁迫时保护酶活性开始升高以清除逆境条件下产生的活性氧[22]，因此保护酶活性高低可用于检验环境中是否存在活性氧诱因，同时也是植物体在活性氧诱导下启动自身防御机制的正常反应[23]。高芳等[24]研究指出，随镉浓度的升高豫花15号叶片SOD和POD活性表现为先升高后降低，而CAT表现为先降低后升高再降低的变化趋势，但其总的趋势是下降。Wang X M等[25]研究认为，在镉处理下油菜POD和CAT活性呈先升高后降低的变化趋势，且POD活性对镉胁迫较SOD和CAT敏感。可见，保护酶在不同植物上的表现存在差异。本试验结果表明，在镉浓度0-1.5mmol/L范围内，三叶草叶片的SOD、CAT和POD活性上升，继续增加Cd浓度其活性下降，这可能是因为在低浓度的镉胁迫条件下，三叶草叶片SOD、CAT和POD活性随体内活性氧的增多应激性升高，三者协同作用清除自由基和过氧化物，防止自由基对植物机体的毒害，而当重金属镉浓度较高时活性氧进一步增多，超出了保护酶抗氧化能力范围，酶蛋白受到损伤，酶的生物合成调节系统也遭受破坏，酶的活性降低，这与Dinakar N等[26]在镉对落花生(ArachishypogaeaLinn.)幼苗保护酶活性影响上的研究结果相一致。APX活性在镉浓度0.5mmol/L时最高，继续增加镉浓度其活性呈下降趋势，这可能是因为APX以抗坏血酸(ASA)作反应底物，其活性与ASA浓度正相关，在高浓度镉胁迫下ASA浓度减小致使APX活性随之降低[27]。