混合青贮微生物多样性研究进展

宗亚倩， 韩 博， 段新慧， 周 凯， 何承刚， 姜 华

(云南农业大学动物科学技术学院， 云南 昆明 650201)

青贮作为一种保存饲料的手段已有3 000多年的历史，是常见的保存牧草的方法，可以减少牧草损耗，保障青绿饲料全年平衡供应[1-5]。随着我国北方草地退化，土地沙漠化程度扩大，饲料短缺成为限制畜牧业发展的主要因素[6]。许多学者因地制宜，利用一些非常规饲料资源(如农作物秸秆、粮经副产物、轻工业生产的副产品等)进行生产混合青贮饲料，不仅可以发展节粮型畜牧业，还能缓解饲草原料短缺带来的压力，这也是当今世界饲料发展的一种趋势[7-8]。混合青贮是将两种或两种以上原料混合在一起，利用乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)发酵来实现长期保存青绿饲料的一种存贮方式[9-10]。其通过原料之间的互补作用，来增加有益微生物数量或抑制不良发酵，进而提高青贮品质[11-12]。混合青贮作为一种贮存技术，具有延长饲料储存时间、调节水分和糖分、增加原料的利用价值、调整饲料供应时期、提高饲草消化率和动物适口性等优点。从扩大资源利用率、减少环境污染、提高农副产品的附加值等角度来看，混合青贮十分必要[7]。

青贮饲料拥有一个复杂的微生物体系，主要由原料表面附着微生物、发酵微生物和腐败微生物参与[13]。对于混合青贮饲料而言，良好的微生物发酵环境是调制成高品质青贮饲料的关键，微生物群落组成及其动态演替直接影响发酵品质[14]。现有研究表明，在可能影响青贮发酵的众多因素中，微生物类型通常决定了青贮饲料的最终质量[15-16]。因此，为更好预防青贮饲料品质下降，本文就青贮饲料发酵过程中的微生物群落及演替过程进行详细阐述，分析混合青贮饲料中优势微生物组成，阐明影响混合青贮微生物多样性的原因，为调制优质的混合青贮饲料提供科学依据。

1 青贮微生物群落组成与演替过程

青贮是各种微生物共同作用的结果[17-18]，而参与发酵的微生物主要来源于牧草表面附着的微生物，其在青贮发酵过程中具有重要作用。附着的微生物中除了有促进青贮饲料发酵的乳酸菌外，还有引起青贮腐败变质的微生物，主要有梭菌属(Clostridium)、醋酸菌(Acetobacter)、酵母菌、霉菌等[19]。植物表面环境的特殊性，使得植物表面附着的微生物种类和数量随植物生长环境的不同存在显著差异[20-22]。但是一般来说，这些青贮原料一旦进行密封青贮后，其在发酵和贮藏过程中发生生理生化和微生物菌群的变化大致相似。如表1所示，在青贮发酵过程中微生物种类和数量是呈动态变化的，通常青贮原料表面附着的好氧细菌、肠杆菌、酵母菌和霉菌等微生物数量较多。在开始时，青贮环境中还有氧气的存在，这时好氧细菌生长旺盛。同时，球状的链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)和片球菌(Pediococcus)也在活动，进行乳酸发酵后，乳酸菌开始大量增殖并产生乳酸，其后随着厌氧和酸性环境的形成，好氧的和不耐酸的微生物逐渐减少，逐渐被乳杆菌(Lactobacillus)和片球菌共同取代，成为乳酸发酵的优势菌[23-26]。Ennahar等[27]发现，在青贮饲料发酵早期主要的优势菌群为片球菌，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，随后被乳杆菌、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)和布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)等更耐酸的乳酸菌代替。在籽粒苋(Amaranthushypochondriacus)与全株玉米(Zeamays)混合青贮前后微生物种类和数量的研究中发现，其微生物也存在这样的演替规律，在新鲜样品中以乳酸球菌的肠球菌(Enterococcus)、乳球菌(Lactococcus)、类肠膜明串珠菌(Leuconostoc)为优势菌群。经过青贮发酵后，乳酸杆菌演替为优势菌群，并且经青贮发酵乳酸菌数量增加，大肠杆菌和霉菌消失，而酵母菌数量变化较小[28]。蒋慧[29]将骆驼刺(AlhagisparsifoliaShap.)与紫花苜蓿(MedicagosativaL.)按不同比例进行混合，比较混贮前后乳酸菌和酵母菌总数的变化，发现青贮后乳酸菌数量显著高于青贮原料，酵母菌数量显著低于青贮原料。在青贮发酵过程中，原料本身的营养成分是保证饲料发酵成功的重要部分。但是，微生物的群落结构及其演替过程也同样重要，所以了解这些信息可有效调控青贮饲料的发酵过程，为调制优质的青贮饲料提供技术支持。

表1 青贮发酵过程不同微生物菌群变化[23-26]Table 1 Changes of microbial communities during silage fermentation[23-26]

2 混合青贮微生物多样性

有些原料因自身种类、含水量、化学成分等原因，常规青贮难以调制成优质青贮饲料，必须要与其他原料混合青贮才能达到发酵条件。混合青贮可调和水分、提升营养价值、改善适口性和提高发酵品质等，其常见原料包括常规牧草，各种饲料作物以及农、轻工业副产物等(米糠、甜菜渣、麦麸、各种酒糟以及水果渣等)。目前研究集中在单一青贮中微生物活动特性上[30]，而对于混合青贮对发酵体系内微生物的影响报道较少，混合青贮如何通过改变微生物特性提高青贮成功率尚不明晰。

2.1 高蛋白饲草与高糖类饲草混合青贮

禾本科牧草水溶性碳水化合物含量高、缓冲能低，蛋白质含量少，单独青贮往往致青贮营养品质不佳。像紫花苜蓿这样的豆科牧草因水溶性碳水化合物含量低，蛋白质含量和缓冲能高，单独青贮较难成功，常常会导致梭菌等有害微生物活动旺盛[31]。但是将其与禾本科牧草进行混合青贮，两者互补可达到较好的青贮效果[32-33]。青贮过程中微生物群落变化，可能是导致青贮质量差异的关键因素，对此学者们对豆科牧草与禾本科牧草混合青贮中的微生物群落组成进行了深入的研究。张朝阳[34]用富含蛋白质的草木樨(MelilotussuavcolenL.)分别与青绿玉米、玉米秸秆和小麦(TriticumaestivumL.)秸秆混合青贮，发现其优势微生物组成和丰富度各不相同，与青绿玉米混合青贮主要以乳杆菌属为主；与玉米秸秆混合青贮主要是以魏斯氏菌属(Weissella)为主；而与不同比例的小麦秸秆混合青贮优势菌不同，以克雷伯氏菌属(Klebsiella)或植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)属为主。一般来说，禾本科牧草的水分和自带的微生物种类不同，进而导致混合青贮饲料优势菌不同。饲用大豆(Glycinemax)分别与玉米和高粱(Sorghum)混合青贮后，乳酸菌和魏斯氏菌属是所有青贮样品的优势菌[35]。Li等[36]在三叶草与多花黑麦草(LoliummultiflorumL.)混合青贮中发现乳杆菌为其优势菌，其次为片球菌和芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus)。紫花苜蓿与全株玉米以不同比例混合青贮，细菌群落发生改变，当玉米从0%增加到40%时，乳杆菌的相对丰度增加，根瘤菌(Rhizobium)和甲基杆菌(Methylobacterium)数量减少，混合全株青贮玉米后可以增加启动发酵的优势菌的相对丰度[37]；在紫花苜蓿与甜高粱(Sweetsorghum)不同比例混合青贮中分离出19株乳酸菌，分别是鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、植物乳杆菌、耐久肠球菌(Enterococcusdurans)、肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconstocmesenteroidessubsp.mesenteroides)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)[38]。将富含蛋白质的构树(Broussonetiapapyrifera)与多年生黑麦草(LoliumperennL.)进行混合青贮，能够提升乳杆菌和魏斯氏菌等有益微生物在整个青贮发酵过程中的主导地位，减少肠杆菌的数量，为反刍动物的可持续生产提供良好的饲草资源[39]。

用富含蛋白质的牧草与富含可溶性碳水化合物的饲料进行混合青贮，可以提升营养成分，更有利于有益微生物的生长繁殖。虽然同一混合青贮类型微生物组成存在差异，整体来说，混合青贮可以更好地保存饲料营养价值。

2.2 高水分青贮原料与干饲料混合青贮

在农产品生产与加工过程中会有大量秸秆、尾菜、酒糟、薯渣、果渣等农副产品和轻工业副产品生成。大多数的农副产品纤维素含量高，营养品质差，含水量低。而多数的轻工业副产品正好与之相反，具有较高的营养价值，蛋白质含量高，是优质的粗饲料来源，但是含水量高，不易单独青贮。高水分青贮往往面临出水流失和梭状芽孢杆菌发酵的高风险，导致大量干物质损失、蛋白质分解严重、丁酸产量高，从而降低饲料消化率、氮利用率和家畜的采食量[40-41]。将这两者混合青贮可以互相弥补彼此的不足，调节微生物族群，减少不良微生物的丰度，提高发酵质量[42]。如在稻草与黑麦草混合青贮过程中优势菌主要有植物乳杆菌、类肠膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)、食窦魏斯氏菌(W.cibaria)、短乳杆菌，随着青贮时间延长，优势菌数量下降[43]。李梦玉[44]从不同发酵时间的玉米秸秆与废弃白菜(Brassicapekinensi)混合青贮的饲料中，检测出肠杆菌(Enterobacter)、乳杆菌、肉食杆菌(Carnobacterium)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、泛菌(Pantoea)、明串珠菌等近27个细菌属。但并不是所有玉米秸秆和白菜混贮饲料中优势菌都是相同的，李志忠等[45]从中分离得到优势菌群却是植物乳杆菌、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)和短乳杆菌，混贮发酵体系中的乳酸杆菌较乳酸球菌丰富。戚如鑫[46]发现稻草与白菜尾菜混合青贮后的优势属主要有乳杆菌属、明串珠菌属、肠杆菌属、乳球菌属(Lactococcus)、短小杆菌属(Curtobacterium)、克雷伯氏菌属、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)等。任海伟等[47]将白酒糟和菊芋渣(HelianthustuberosusL.)进行混合发酵，通过高通量测序技术解析发酵微生物菌群多样性发现，混合发酵以厚壁菌门乳杆菌属细菌为主。王聪[48]将甜高粱秸秆和酒糟混合青贮发现乳杆菌属和片球菌属为属水平优势菌。Ren等[49]在玉米秸秆与甘蓝(BrassicaoleraceavarcapitataL.)废弃物的混合青贮饲料中发现乳酸杆菌和明串珠菌为优势乳酸菌，在混合青贮过程中抑制了肠杆菌科、假单胞菌、黄杆菌和泛菌等不良微生物的生长。玉米与荞麦(Fagopyrumesculentum)混合青贮饲料中，优势菌群有假单细胞菌属、乳杆菌属、泛菌属、链霉菌属(Streptomyces)、魏斯氏菌属、明串珠菌属、贪铜菌属(Cupriavidus)、乳球菌属、肠杆菌属、沙雷菌属(Serratia)[50]。高水分玉米茎秆和柱花草(StylosanthesguianensisSw.)与洋紫荆(BauhiniavariegateL.)花茎混合青贮后细菌多样性增加，肠杆菌和梭菌的相对丰度降低，乳杆菌、威瑟拉菌和肠球菌等产乳酸细菌的相对丰度增加[51]。

3 混合青贮微生物多样性影响因素

3.1 混合比例和原料对微生物的影响

在青贮发酵过程中，微生物主要来自青贮原料表面天然微生物群落。微生物菌群因饲料作物的特性以及环境条件的不同，使得饲草本身附着微生物群落结构有着显著的差异[34,52]，因此不同混合比例、不同青贮原料的青贮发酵体系中微生物结构也各不相同。

就混合比例而言，两种青贮原料参与青贮的比例不同，一方面会改变整个青贮体系中优势菌群的丰度，另一方面会改变青贮原料的营养成分。这些改变都会引起混合青贮饲料中微生物菌群结构发生变化。商振达等[50]以全株荞麦与全株玉米为青贮原料进行混合青贮，发现两者以不同比例进行混合青贮60 d后，优势菌属和丰度值均发生改变。李茂雅等[53]在探究皇竹草(PennisetumsineseRoxb)与茅台酒糟不同混合比例对微生物多样性的影响中发现，两者混合青贮后优势菌属虽均为乳杆菌属，但是随着茅台酒糟混合比例的降低，青贮饲料中乳杆菌属的相对丰度逐渐增高，在90%皇竹草+10%茅台酒糟青贮中，乳杆菌属相对丰度最高。

由此可以看出，两种原料按不同比例进行混合青贮，青贮体系中微生物的组成和丰度值会产生较大的改变，引起这些变化的原因可能与原料本身的含水量、可溶性糖以及有益菌丰度等密切相关。

从青贮原料来看，不同植物由于表面微环境的特殊性，附生或寄生于植物表面的微生物群体存在一定差异，与不同原料进行混贮后微生物多样性也会随之发生改变。Ni等[35]分析了饲用大豆与玉米、高粱混合青贮对微生物群落的影响，结果表明，乳杆菌和魏斯氏菌虽是所有青贮样品中的优势微生物，但它们的相对丰度各不相同，且饲用大豆+高粱所有青贮中乳杆菌的丰富度均高于饲用大豆+玉米青贮。将紫花苜蓿与全株青贮玉米进行混合青贮后，细菌群落主要由乳酸杆菌、威塞拉菌和片球菌组成[54]。韩吉雨等[55]在探究苜蓿和玉米青贮中得出的结论是原料表面附着的细菌贯穿整个发酵过程，说明原料本身附着的微生物对青贮微生物多样性影响很大。

3.2 青贮时间对微生物多样性的影响

同一饲料不同发酵时期微生物种类和丰富度是处在一个不断变化的状态，青贮前、贮藏期以及开窖之后差异显著。孙安琪[56]证实了白酒糟原料附着的细菌主要是乳杆菌、伯克氏菌(Burkholderia)、不动杆菌(Acinetobacter)、志贺氏菌(Shigella)等，菊芋渣原料附着的主要是乳杆菌，两者混合青贮10 d时，优势细菌以乳杆菌和芽孢杆菌属为主，30和60 d时，优势细菌均以乳杆菌属为主，且随着青贮时间的延长乳杆菌丰富度不断增加。刘蓓一等[57]以稻草秸秆和多花黑麦草为青贮原料，以不同比例进行混合青贮，观察了其不同发酵时期青贮微生物的动态变化，发现不同青贮时期乳酸菌、酵母菌和霉菌数量不同且随着青贮时间延长，优势菌数量下降。卢强等[58]分析了紫花苜蓿不同发酵时期的微生物群落，发现同样规律，在发酵初期乳球菌属和肠球菌属发挥主要作用，在发酵后期，乳酸杆菌属、乳球菌属、肠球菌属占主导优势，并且肠杆菌属及霉菌等数量减少，乳球菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属等在不同阶段的丰度值有较大区别。青贮发酵是微生物动态变化的过程，在发酵过程中微生物会产生一些代谢产物[59]，使整个青贮环境的发生改变，微生物为适应当时环境，在种类和数量上随之改变。

4 存在的问题与展望

近年来随着我国畜牧业的快速发展，饲料供应不足已成为限制畜牧业可持续发展的重要因素。混合青贮饲料因其营养全面，原料来源广，逐渐被大家所认知并成为研究热点。目前，关于混合青贮的研究主要集中在混合青贮对发酵品质及微生物多样性的影响，对于乳酸菌抗菌性研究、混合青贮饲料的推广利用以及对动物生产性能研究仍存在不足之处。

4.1 乳酸菌抗菌性研究

乳酸菌广泛用应于食品、医疗和养殖等多个领域中，是公认的安全级微生物，在人和大多数动物肠道内都有存在，具有抑制细菌和真菌的特性。研究表明乳酸菌代谢产物具有较广的抑菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等都有很好的抑制作用，能减缓有害微生物生长速度、延长微生物停滞期、减少微生物成活数量，增强免疫力和保护机体的作用[60-62]。目前，对于乳酸菌抗菌性的研究主要集中在泡菜、冷鲜猪肉等食品中，而关于混合青贮中乳酸菌抗菌活性的研究较少，从不同地域和不同混合青贮饲料中筛选具有抑菌活性的乳酸菌并研究其抑菌机理将会成为未来研究的重要方向。

4.2 混合青贮推广

混合青贮可以实现原料互补，提高青贮品质，增加有益微生物数量，降低饲养成本，获得优质畜产品，缓解饲料短缺带来的压力，具有很大的开发潜力。由于非常规饲料资源存在季节性、分布不集中、产业化程度低等因素的影响，使之推广利用程度比较低。目前，非常规饲料资源的各种性能没有得到全面的开发和利用，今后应关注粮经副产物集中回收管理与利用、混合青贮配比技术研究，为混合青贮饲料的科学合理利用提供理论依据。

4.3 混合青贮对动物生产性能研究

青贮饲料在反刍动物养殖中起到不可或缺的作用。近年来，随着混合青贮饲料的兴起，学者们进行了广泛的关于动物生产性能的研究，如日增重、产奶量、饲料转化率以及产蛋、乳量。未来应进一步关注混合青贮微生物群落变化对动物瘤胃微生物的影响，如何促进动物生长、调控肠道健康、改善奶制品和肉制品质量的具体作用机理以及不同生长阶段混合青贮饲料的合理喂养量等方面的研究，为混合青贮饲料利用提供一定的理论基础。