时间:2024-07-28
李争艳,徐智明,师尚礼,贺春贵
(1.甘肃农业大学草业学院,甘肃 兰州 730070; 2. 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽 合肥 230031)
生态系统地上地下部分是相互关联的,植物与土壤微生物间的作用是生态系统地上与地下结合的纽带[1],研究土壤微生物,了解地上地下生态过程之间的作用与反馈,揭示两者间的相互作用有助于深入了解生态系统稳定维持的内在机制。土壤酶是土壤有机质分解、土壤生物活性和代谢速度的良好指示物[2]。土壤微生物群落结构是土壤健康的重要决定因素,受到耕作、施肥、灌溉、地域、作物种类[3-6]等的综合影响。土壤微生物群落变化可导致土壤代谢能力和土壤质量的变化。同种植物不同品种根系分泌物组成成分不同,这种差异会导致根际土壤理化性质、酶活性、微生物群落结构以及动物群落发生变化,变化了的土壤环境会导致土壤养分利用率、植物的生长抗逆、品质产量等发生改变[7-10]。因此,同种植物的不同品种根际土壤酶活性、微生物多样性等的差异,可能与植物引种表现有一定的联系[11]。选择适合当地条件的品种,不仅可以提高作物的产量和品质,还可以提高土壤养分,酶活性,从而改善土壤微生态环境,为农业可持续发展提供有利条件。
高丹草(Sorghum-sudangrasshybrid)是高粱(Sorghumbicolor)与苏丹草(Sorghumsudanense)杂交产生的一年生禾本科饲料作物,其分蘖力和再生性都比较强,高产且营养丰富;和高粱相比,具有抗旱节水、超晚熟、营养生长期长等特点,具有广阔的利用前景[12]。随着我国奶业不断发展,对优质牧草的需求不断加强,国内高丹草种植面积增加、范围扩大,逐步形成产业化及规模化态势。近年来,江淮地区土地利用结构发生较大变化,在产生一定经济效益和社会效益的同时,其生态环境发生了一系列变化,生态效益日益成为人们关注的焦点。目前,江淮地区不同品种高丹草土壤根际细菌群落多样性情况仍不清楚,因此本文以江淮地区4个高丹草品种的根部土壤为研究对象,探讨不同高丹草品种对土壤微生态环境的影响,分析不同高丹草品种间土壤细菌群落多样性的差异及相关关系,以期为江淮地区优质高丹草品种的引种选育提供相关科学依据,为草地生态环境保护提供理论指导。
试验在安徽省五河县朱顶镇(117°26'~118°04' E,32°55'~33°20' N)秋实草业公司试验基地进行。海拔16 m,年降雨800~1000 mm,年平均气温15.1℃,无霜期216 d,土壤类型为典型的黄潮土。
供试高丹草(Sorghum×Sudangrass)品种分别为海牛(光敏型,Monster)、大卡(光敏型+褐色中脉Brown Midrib(BMR)型,Big Kahuna)、高丹草BJ0603(光敏型),帕卡(光敏型,Pa Kahuna),草种由百绿(天津)国际草业有限公司提供。试验采用随机区组设计,3次重复,小区面积13 m×6 m,行距40 cm,株距30 cm,播种前试验地已撂荒3年,4个品种统一施底肥(N:180 kg·hm-2;P2O5:240 kg·hm-2;K2O:300 kg·hm-2),深翻整地、穴播种植,密度10.33万株·hm-2,整个试验期不灌溉,苗期及拔节期各人工除草一次,试验区农艺管理及杂草控制统一管理。
于2016年10月,在高丹草孕穗期,用直径为2.5 cm土钻按S点取样法在每个小区选5个点的土壤样品,深度为0~20 cm,直径2.5 cm。在清除表面植物覆盖物后取样,将5个样品混为1个土样,放入无菌自封袋。每个样品分3份,1份-80℃保存,用于DNA提取;1份风干,过2 mm筛,进行化学分析;另外1份鲜样送达实验室立即进行酶活性检测。同时在距离植株15 cm处挖剖面分层取样,土层深度分别为0~10 cm,10~20 cm,20~30 cm,每个小区设3个重复,用铝盒现场称湿重装入自封袋,带回实验室测土壤容重。
1.3.1土壤理化性质测定 新鲜土壤和去离子蒸馏水按1:2.5体积比混合,制成悬浮液,插入玻璃电极计来测量土壤pH值[13]。环刀法测量土壤容重,采用重铬酸钾法对有机质(OM)含量进行定量,总氮(TN)和有效磷(Available phosphorus,AP)分别用凯氏定氮法和钼锑反光度法进行定量,速效钾(Available potassium,AK)用火焰光度法测定[14]。土壤酶活性采用土壤酶活性试剂盒(南京建成)测定。
1.3.2DNA提取、16S基因扩增及Illumina Miseq测序 土壤微生物基因组DNA采用土壤DNA试剂盒(上海生工)从每个土壤样品中分离得出,使用分光光度计(A260/A280)对DNA浓度和质量进行定量,确保所有DNA产量在1~2.5 mg之间。利用引物338F(5’-ACTCCTACGGAGCAGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3’)扩增细菌16S rRNA基因V4-V5区的468bp片段。20 μL反应体系:5×FastPfu 4 μL、dNTPs(2.5 mM)2 μL、正向引物(5 μM)0.8 μL、反向引物(5 μM)0.8 μL、FastPfu 0.4 μL、DNA模板10 ng、BSA 0.2 μL,加ddH2O至20 μL。PCR参数:95℃持续3 min(变性);PCR程序:95℃30 s;55℃30 s;72℃45 s;72℃10 min;25个循环(ABI GeneAmp®9700)。PCR产物在Illumina Miseq平台测序(http://www-MaigrBio.com)。97%的同源性下进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTU)分析,物种分类信息利用Silva数据库(Release128 http://www.arb-silva.de)进行比对,数据处理图形生成均在Majorbio I-Sanger云平台(www.i-sanger.com)进行。
采用Excel 2010进行试验数据计算与图表绘制;采用SPSS 15.0进行统计分析,P<0.05在统计学上有显著差异,P<0.01表示差异极显著。采用单因素方差分析(ANOVA)和Fisher最小显著差异(LSD)检验进行多重比较。
从表1可以看出,各品种均随着土层加深,容重增大,土壤越来越紧实。在0~10 cm土层,GDC根部土壤容重达到1.54 g·cm-3,显著高于其他品种(P<0.05),HN与DK根部土壤容重处于中间水平,PK根部土壤容重最小,显著低于其他3个品种(P<0.05);在10~20 cm土层,GDC根部土壤容重显著高于其他3个品种;20~30 cm土层依然是GDC根部土壤容重显著高于其他品种(P<0.05),而且GDC根部土壤容重在20~30 cm土层容重保持不变。总之,GDC根部土壤容重在各土层都显著高于其他品种,说明相较其他品种,GDC根部土壤孔隙度小,不利于根系的生长,而PK显著降低了根部土壤容重,根系较为发达,土壤发育良好。
表1 不同品种光敏型高丹草对土壤容重的影响Table 1 The effect of different cultivars on bulk density of soil
注:HN:海牛Monster;DK:大卡Big Kahuna;GDC:高丹草BJ0603;PK:帕卡Pa Kahuna。不同的小写字母表示同一指标(列)不同处理差异显著(P<0.05),下同
Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different treatments in the same index (column) at the 0.05 level,the same as below
HN根际土壤pH值为7.88,显著低于其他3个品种(P<0.05);GDC根际土壤OM含量最低,为15.26 g·kg-1,显著低于HN、DK和PK(P<0.05);HN和PK根际土壤TN含量分别为1.74 g·kg-1及1.90 g·kg-1,显著高于DK和GDC(P<0.05);4个品种根部土壤中AP含量差异不显著(P>0.05);HN和PK根际土壤AK含量较低,分别为257.13 mg·kg-1及317.63 mg·kg-1,显著低于GDC及DK(P<0.05)(表2)。品种间土壤养分的差异吸收可以引起根际土壤pH值的变化及根部土壤化学性质的改变,而pH值的差异又与土壤根际微生物多样性、酶活性等互相作用。
表2 不同品种光敏型高丹草对土壤化学性质的影响Table 2 The effect of different cultivars on chemical characteristics of soil
从图1可以看出,4个品种根际土壤蔗糖酶活性高低排列顺序为PK>HN>GDC>DK,PK根际土壤蔗糖酶活性显著高于DK;HN,GDC根际土壤蔗糖酶活性分别为35.31 μg NH3-N·g-1soil·24h-1和32.71 μg NH3-N·g-1soil·24h-1,与PK、DK根际土壤糖酶活性差异均不显著(P>0.05),DK的蔗糖酶活性最低为29.74 μg NH3-N·g-1soil·24h-1(图1A);4个品种根际土壤过氧化氢酶活性差异不显著(P>0.05)(图1B);PK与HN根际土壤碱性磷酸酶活性最高,分别为15.77 μmol phenol·g-1soil·24h-1和16.77 μmol phenol·g-1soil·24h-1,显著高于GDC(P<0.05),DK根际土壤碱性磷酸酶活性居中,为13.00 μmol phenol·g-1soil·24h-1(图1C);而PK根际土壤脲酶活性显著高于其他3个品种(P<0.05),达到2368.15 μg NH3-N·g-1soil·24h-1,DK,HN,GDC均显著低于PK,但三者之间差异并不显著(P>0.05)(图1D)。因而可以推断出,PK、HN的根际土壤具有更高的氮磷水解及养分转化能力。
图1 不同品种光敏型高丹草对土壤酶活性的影响Fig.1 The effect of different cultivars on soil enzyme activities
2.4.1土壤样品序列稀释曲线 从江淮地区HN、PK、DK和GDC 4个光敏型高丹草品种土壤中分别获得了36180,38708,36654,37150条有效序列。对有效序列进行了随机抽样,用序列数与其代表OTU数目形成稀释曲线,样品序列的稀释曲线逐渐趋于平缓(图2)说明测序数据量合理,基本能真实反应土壤细菌群落多样性。
2.4.2不同品种光敏型高丹草对根际土壤细菌门水平群落组成变化的影响 从图3A可以看出,变形菌(Protecbacteria),拟杆菌(Bacteroidetes),厚壁菌(Firmicutes)在各品种根际土壤中均为前3位相对丰度高于10%的优势细菌。而从PK根际土壤细菌组成看,变形菌(Protecbacteria),拟杆菌(Bacteroidetes),厚壁菌(Firmicutes)所占比值分别为27.85%,18.40 %,11.02 %;DK根际土壤变形菌(Protecbacteria),拟杆菌(Bacteroidetes),厚壁菌(Firmicutes)所占比值分别为37.51%,20.03 %,13.08 %;HN根际土壤变形菌(Protecbacteria),拟杆菌(Bacteroidetes),厚壁菌(Firmicutes)所占比值分别为35.45%,20.14 %,13.24 %;GDC根际土壤变形菌(Protecbacteria),拟杆菌(Bacteroidetes),厚壁菌(Firmicutes)所占比值分别为36.62%,20.00%,13.24%(图3A)。在4个品种中,丰度最高的前3位的细菌,变形菌(Protecbacteria)相对丰度DK(37.51%)>GDC(36.62%)>HN(35.45%)>PK(27.85%);拟杆菌(Bacteroidetes)相对丰度HN(20.14%)>DK(20.03%)>PK(18.40%)>GDC(20.00%);厚壁菌(Firmicutes)相对丰度HN(13.24%)=GDC(13.24%)>DK(13.08%)>PK(11.02%)。变形菌(Protecbacteria),拟杆菌(Bacteroidetes),厚壁菌(Firmicutes)在PK根际土壤中细菌的相对丰度均小于其他3个品种。
图2 基于OTU丰度的土壤样品微生物群落的稀释曲线Fig.2 Rarefaction curves of soil microbial communities based on OTU richness
不同品种光敏型高丹草对根际土壤不同细菌门的相对丰度显著性差异如图3B所示,图中比较了丰度最高的前15个细菌门类不同细菌的相对丰度。结果显示,DK根际土壤中变形菌(Proteobacteria)的相对丰度显著高于其他品种(P<0.05),PK根际土壤中变形菌(Proteobacteria)的相对丰度最低,而PK根际土壤中优势菌群的低丰度表达也说明其土壤细菌菌群结构更为稳定。PK根际土壤中酸杆菌(Acidobacteria)、放线菌(Actinobacteria)及未分类细菌、未分离培养细菌的表达丰度都要显著高于其他品种(P<0.05),说明PK根际土壤中土壤细菌各类群分布均匀,优势种地位不突出,群落结构将更为稳定。其他细菌在4个品种根际土壤中的相对丰度差异不显著(P>0.05)。
2.4.3不同品种光敏型高丹草对根际土壤细菌群落多样性的影响 通常认为:物种丰富度ACE指数、丰富度实际观测值Sobs值、物种丰富度Chao指数反映了群落丰富度[15,16],Shannon多样性指数反映了群落多样性[17]。群落丰富度越高,则样本土壤微生物优势种群越突出,该优势种群比例越高,导致该类型总体的均匀度下降而优势度增加。群落多样性指数(Shannon)越低,而多样性指数越高,优势物种丰富度越低,土壤微生物环境越稳定。由图4可以看出,不同高丹草品种根际土壤细菌OTU水平上Shannon指数差异显著,排列顺序为PK>GDC>DK>HN,PK高于其他3个品种,且达到极显著水平(P<0.01),GDC高于DK且差异达到了显著水平(P<0.05),DK高于HN,且差异达到极显著水平(P<0.01),HN与GDC之间差异不显著(P>0.05)(图4A);PK根际土壤细菌多样性Chao指数(图4B)与Sobs指数(图4D)均显著高于其他3个品种(P<0.01),DK、HN、GDC之间差异不显著(P>0.05);PK土壤中细菌多样性ACE指数显著高于HN(P<0.01),其他品种间差异不显著(P>0.05)(图4C)。说明PK根际土壤细菌各类群分布均匀,优势种地位不突出。
图3 不同品种光敏型高丹草根际土壤细菌的相对丰度变化Fig.3 Changes of soil bacterial relative abundance in different cultivars注:PK:帕卡Pa Kahuna;HN:海牛Monster;DK:大卡Big Kahuna;GDC:高丹草BJ0603。Protecbacteria:变形菌门;Bacteroidetes:拟杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Candidate_division_SR1:未分离培养细菌;Acidobacteria:酸杆菌门;Chloroflexi:绿湾菌门;Spirochaetae:螺旋菌门;Chlorobi:绿菌门;Nitrospirae:硝化螺旋菌门;Candidate_division_OD1:未分离培养细菌;Planctomycetes:浮霉菌门;Gemmatimonadetes:芽单胞菌门;unclassified_k_norank_d_Bacteria:未分离培养细菌;Actinobacteria:放线菌门;WCHB1-60:未分离培养细菌:Candidate_division_WS6:未分离培养细菌;Candidate_division_TM7:未分离培养细菌;“Others”是所有相对丰度低的稀有细菌门的总和,“Others” are the sum of all rare bacterial phyla with low relative abundances
图4 不同品种光敏型高丹草对根际土壤细菌在OTU水平多样性的影响Fig.4 Soil bacteria composition diversity at OTU level in different cultivars注:采用t检验评估OTU水平各样本的细菌多样性。 * P<0.05,** P<0.01Note:Student t tests are used to estimate the bacterial diversity of each sample at OTU level. * P<0.05 and ** P<0.01
光敏型高丹草不同品种土壤细菌群落多样性与土壤OM、TN、AP、AK的冗余分析(Redundancy analyses,RDA)如图5所示。图中带箭头的线段表示土壤环境因子,其所指方向为环境因子的变化趋势,带箭头的线段与排序轴间的夹角的大小,表示该土壤环境因子与排序轴的相关性的大小,且线段长度越长、与排序轴之间的夹角越小,表明相关系数的绝对值就越大;由图5可以看出第一、二排序轴累计解释率分别为39.70%和16.28%,前两轴共解释了物种-环境关系总方差的55.98%,说明前两轴能够反映出细菌群落多样性与土壤理化因子间的相互关系。TN、OM是影响土壤细菌群落多样性的主要影响因子。
图5 细菌群落组成与土壤理化性质的冗余分析Fig.5 Redundancy analyses (RDA) between bacterial community composition and soil chemical properties注:TN:总氮,total nitrogen;pH:pH值;OM:有机质,organic matter;TN:总氮,total nitrogen;AP:总磷,available phosphorus;AK:速效钾,available potassium
土壤容重反映了土壤通气性、透水性及植物根系生长状况,容重值大小决定于土壤的质地结构及松紧程度,土壤容重越小,说明孔隙度越大,土壤发育良好[18]。不同品种对植株根部土壤容重产生影响主要是通过根系作用[19],根系生长状态良好,土壤发育较好,较为疏松。本研究结果显示,GDC在各土层容重都显著高于其他品种,可能是由于其根系不发达,土壤孔隙度小,而PK根部土壤容重显著低于其他3个品种,土壤发育良好,土壤容重的差异可能是由于不同品种生长差异,根系差异引起的。
不同品种遗传特性以及对营养元素选择吸收不同,根系的分泌物也不同,根际分泌物的不同影响了根际土壤的酸碱性,同时,根系分泌物也会对根区养分的活化与利用产生影响,因而造成土壤残留养分及根系环境的差异[20],有研究结果显示,苎麻(Boehmerianivea(L.) Gaudich)[21]、茶树(Camelliasinensis)[22]不同品种的根际土壤pH值不同,与其结果相似,本研究表明,4个品种的光敏型高丹草根部土壤pH值显示出品种差异,且HN根部土壤pH值显著低于其他3个品种(P<0.05)。土壤养分含量可通过调节土壤的生物学特性[23]来调节植物根际养分吸收,有研究表明,苜蓿(MedicagoSativaL.)不同品种对土壤铬、铅等重金属的累积吸收在苜蓿不同生长阶段及不同品种间均有差异[24]。刘落鱼等[25]对10种茶花(CamelliajaponicaL.)品种的土壤特性研究表明,不同品种的茶花根际土壤养分含量有显著差异,与其结果相似,在本研究中,HN和PK根际土壤TN含量显著高于DK和GDC(P<0.05),DK和GDC根际土壤速效钾含量显著高于HN和PK(P<0.05),PK、HN及DK根际土壤OM含量均显著高于GDC (P<0.05),说明不同品种光敏型高丹草对土壤养分需求不同,因而在施肥管理中,DK和GDC要适当多施氮肥,HN,PK要适当增加钾肥,从OM差异可以看出PK,HN及DK较GDC根际土壤更为肥沃。
土壤酶活性是土壤生物化学过程的重要指标[26],土壤酶活性的大小可以反映土壤养分转化的能力,脲酶和碱性磷酸酶参与氮磷循环和有机质的分解[27],过氧化氢酶是一种可以减轻生物体内毒素的氧化还原酶,蔗糖酶能够催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖,进而提高土壤生物学活性,增加土壤营养[27]。很多研究表明,植物不同品种根际土壤的酶活性存在差异,杨统一等[11]对不同抗病桑树(MorusalbaL.)品种根际土壤特征研究发现,高抗桑树品种根际土壤中的硝酸还原酶活性显著高于易感品种,中抗桑树品种根际土壤中的亚硝酸还原酶活力显著高于高抗和易感品种;不同茶花品种根际土壤脲酶、酸性磷酸酶及氧化氢酶酶活性均有显著差异[25]。与前人的研究相似,本研究显示,4个品种光敏型高丹草根际土壤中蔗糖酶活性PK>HN>GDC>DK,说明PK、HN土壤中催化蔗糖水解的能力更强,而HN、PK根际土壤碱性磷酸酶活性也要高于DK及GDC,PK的根际土壤脲酶活性均显著高于其他3个品种(P<0.05),造成这种差异的原因可能是不同品种不同的根系分泌物对于根区养分的活化与利用的差异造成的。
细菌是构成土壤微生物最重要的组成部分,微生物群落变化可导致土壤代谢能力和土壤质量发生变化,微生物多样性的变化是土壤健康的重要决定因素,它们通过影响代谢酶在土壤中的沉积进而影响土壤的质量和功能[28],同时,土壤微生物多样性在可持续农业中发挥着重要作用,因为微生物可以影响土壤养分循环,分解不溶性有机物,将其转化为可吸收利用的形态,从而促进农业生产。已有研究表明,不同山核桃(Caryaillinoensis)品种根部土壤不同微生物表达丰度会有差异[29],与之相似,不同品种高丹草根际土壤细菌门水平,在高丰度的细菌群落结构相似,而在低丰度根际细菌群落结构上存在差异,这也说明,不同品种光敏型高丹草根际土壤细菌群落结构存在一定的品种特异性;油菜(BrassicacampestrisL.)根部土壤变形菌(Proteobacteria)占比最高[30],本研究结果显示,变形菌(Proteobacteria)在细菌结构组成中也属于丰度最高的细菌,而PK根际土壤中优势菌群的低丰度表达也印证了其成为土壤细菌菌群结构更为稳定的因素。可见,PK根际土壤比起其他3个品种,优化了根际土壤环境。PK根际土壤中酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)及一些未分类培养的细菌门类,其表达丰度都要显著高于其他品种(P<0.05)。造成这种差异可能是因为,PK根系分泌物更有利于酸杆菌、放线菌等的生长,而先前的研究[31]表明,酸杆菌(Acidobacteria)在植物残体的降解和碳循环过程发挥着重要作用,放线菌(Actinobacteria)具有磷酸盐溶解能力、铁代谢能力,并通过分泌可降解、难降解有机化合物的次级代谢产物影响其他生物体[32],因此这种差异更有利于PK营养元素的代谢吸收。
植物品种影响着植物根际土壤的微生物组成,据报道,不同茶树品种影响着根系分泌物及凋落物[22],而凋落物的营养元素可促进土壤微生物群落丰富度的提高,促进微生境复杂化,影响着不同品种根际土壤的微生物多样性。不同山核桃品种根际细菌群落因为山核桃品种的差异而显示出不同[29],烤烟(NicotianatabacumL.)根际土壤细菌、放线菌和微生物总量与品种抗性均呈正相关,而真菌数量与品种抗性呈负相关[33]。与之相似,本研究结果表明,PK的Shannon指数和Chao及Sobs多样性指数都显著高于其他高丹草品种,说明该品种高丹草根际土壤细菌各类群分布均匀,优势种地位不突出;PK根际土壤中土壤细菌群落的数量及多样性较高,可能是由于不同品种根系分泌物的不同影响了土壤细菌群落[10]。
很多研究已经证实,土壤物理化学性质对微生物特性有影响,土壤养分在塑造土壤微生物群落中具有很重要的作用[34],同时,土壤微生物结构也会影响土壤理化性质[35]。微生物群落组成及微生物量可以通过土壤的理化性质,如土壤的酸碱度和有机质来调节,并且与土壤健康相关[6,36]。土壤有机质是显示土壤肥力及质量的重要参数,也有研究[37]显示土壤有机质是提高土壤质量和抗病性的关键因素,土壤中的有机质含量与微生物多样性和较高的作物产量也有关系[6],也有研究[25]表明,不同茶花品种土壤有机质与土壤细菌、放线菌呈显著正相关;与他们的研究结果相似,本研究中不同品种根际土壤TN、OM与土壤细菌群落多样性具有较强相关性。原因可能是土壤细菌在自身合成代谢过程中,需同化利用一定量的氮素,因而,土壤氮含量增加会提高微生物数量;有机质含量反映出土壤肥力及土壤质量,肥沃的土壤有利于土壤微生物的生长。
4种光敏型高丹草品种对土壤理化性质、酶活性及根际土壤细菌结构多样性产生显著影响;Illumina Miseq测序显示4种光敏型高丹草品种根际土壤细菌门水平优势类群为变形菌(Proteobacteria),拟杆菌(Bacteroidetes)及厚壁菌(Firmicutes);不同光敏型高丹草品种根际土壤细菌的多样性指数差异表明品种对土壤细菌群落多样性的影响程度有所不同,PK根际土壤在土壤酶活性及细菌群落多样性指数上表现突出;不同高丹草品种营养元素吸收利用效率、酶活性及细菌群落多样性存在差异,可见光敏型高丹草品种的差异是引种、施肥等管理需要考虑的重要因素之一,种植光敏型高丹草时应结合当地情况选择适宜的栽培品种,可结合土壤施肥改良及优化栽培技术等手段调节土壤微生态环境,以增强土壤肥力,提高作物产量及品质。
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