外源香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿根系形态建成与解剖结构的影响

陶 茸，师尚礼，张翠梅，陈建纲，王晓瑛

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

根系不仅是植物吸收水分和矿质营养的重要器官，也是最先感受土壤逆境胁迫的重要部位，其生长发育是遗传因子、外部生物和非生物因素共同刺激作用的结果[1-3]。结构是功能的基础，植物结构的变化必然会影响到生理生态功能的改变，而根系解剖结构是根系发育水平的直接体现，与生理功能关系密切，木质化程度、输导组织、表皮的附属结构等会影响植物抵抗逆境的能力[1,4-5]。植物的防御准备过程在启动了分子信号的同时，也会分泌植物抗毒素—香豆素[6]。陶茸、蔡登高等[7,8]指出香豆素不仅影响苜蓿种子萌发，还影响其幼苗氮代谢和氨同化的关键酶，导致苜蓿体内养分缺失。王婧怡等[9]发现100 μg·mL-1的香豆素水溶液通过改变苏丹草(Sorghumsudanense)抗氧化酶系统、影响酶活性、破坏细胞超微结构等途径调节苏丹草的生长，姚丹丹[10]则认为该浓度下的香豆素水溶液只能在多花黑麦草(Loliummultiflorum)种子发芽和幼苗生长初期可以很大限度地起到抑制作用，但不足以致死。也有研究表明，40 μg·mL-1的香豆素水溶液能显著抑制紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、多花黑麦草、红三叶(Trifoliumpratense)、莴苣(LactucasativaL.)、萹蓄(PolygonumaviculareL)、铜绿微囊藻(Aeruginosa)等植物种子萌发和幼苗生长[11-14]。咖啡酸在一定浓度下能够诱导莴苣体内活性氧的产生和积累，降低幼苗根尖细胞活力，进而影响莴苣幼苗的生长发育，对铜绿微囊藻也具有明显的生长抑制效应[15-16]。

苜蓿作为多年生优质豆科牧草，具有一次种植、多年收获、产草量高、营养丰富和适口性好等特点，有“牧草之王”之称[7]，田晨霞等[17-19]研究了紫花苜蓿叶片及根系的形态和解剖结构对盐碱胁迫、干旱胁迫、低温胁迫以及氮素水平的适应反应，从不同程度揭示了土壤环境对苜蓿叶片和根系的胁迫可能造成叶片、根系形态建成及内部输导组织结构的适应性改变，从而影响植物对养分的吸收和利用。也有研究表明，连茬种植的苜蓿种子由于自毒作用不能正常发育，很难建植成功[20]。香豆素、绿原酸、香豆酸、羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸等酚类物质是造成紫花苜蓿自毒作用的主要物质[21-26]，在苜蓿植株体内随着生育时期而不断累积[27-28]，对多数植物的萌发和生长产生抑制作用。然而香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿根系形态建成与解剖结构的影响鲜见报道，本研究采用营养液沙培法研究紫花苜蓿主要自毒物质香豆素、咖啡酸及两者混合物对紫花苜蓿生长早期根系形态建成与解剖结构的影响，揭示紫花苜蓿根系外部形态与解剖结构之间的相关性，以期为深入探讨香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿生长和发育影响的机理提供依据，为有效缓解和解决苜蓿自毒障碍提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘农9号紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Gannong No.9’)，由甘肃农业大学草业学院实验室提供，发芽率为96.83%。

药剂:香豆素(Coumarin)、咖啡酸(Caffeic acid)均为分析纯品，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，混合物由香豆素、咖啡酸按1∶1比例配制，试验设计中香豆素、咖啡酸及其两者混合物分别用字母C，CF和M表示(见表1)。

1.2 试验方法

试验在甘肃农业大学草业生态系统教育部重点实验室进行，采用营养液沙培法，选用经高温灭菌(121℃，6 h)的等量细沙，将其装入营养钵(下口内径12 cm，上口内径18 cm，高度为15 cm)中，摆放在水培盒(长×宽×高为45 cm×18 cm×10 cm)中，置于光照培养室(每天光照14 h，光通量密度400 μmol·m-2·s-1，昼夜温度分别为(25±1)℃和(20±1)℃，相对湿度60%左右)[29]。将供试种子经75%酒精消毒后选30粒均匀播种在营养钵中，出苗后间苗，每钵保留生长一致的幼苗20株，每3 d浇灌Hoagland营养液300 mL，确保幼苗正常生长，于幼苗4叶期(播种10 d后)每处理施加以Hoagland营养液为母液的外源香豆素、咖啡酸及混合酚酸处理液600 mL进行处理，处理液浓度梯度依据前人研究结果[6-11]，结合预试验设定为0.5，5，50，500 mg·L-1(详见表1)，以施加600 mL不添加外源香豆素和咖啡酸的Hoagland营养液处理为对照(CK)，每处理重复3次。为确保花盆处理液浓度保持不变，每隔1 d给培养盒新添加处理液至600 mL，每7 d用蒸馏水淋洗1次培养盒，并施加新配置营养液。连续处理28 d时，选择3个长势基本一致的植株根进行取材，取根茎下1～2 cm处根段，立即放入FAA固定液(70%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福尔马林5 mL)中，固定24 h以上[18]，分别测定根粗、皮层厚度、中柱直径、导管数量及面积等解剖结构指标。

表1 香豆素和咖啡酸处理配比Table 1 The treatments of coumarin and caffeic acid

1.3 测定指标与方法

1.3.1根系形态指标 用蒸馏水洗净各处理根系，置于盛有去离子水的无色透明水槽中，用镊子调整根位置避免交叉重叠，使用台式扫描仪(EPSON Experssion)进行扫描，再用根系分析系统(Win Rhizo Pro 2004a)分析扫描的图片，获得根系总长度、根表面积、总根体积和根平均直径等形态指标相关数据，每处理重复3次。

1.3.2根系解剖结构 利用石蜡切片技术观察苜蓿幼苗根系解剖结构，参考李正理[30]、李和平[31]的方法对所取材料进行固定、脱水、透明、渗蜡、包埋、切片、脱蜡与复水、染色和封片。使用生物光学显微镜(Zeiss Axioskop40 Germany)观察石蜡切片中根系解剖结构，并用Axio-Vision软件测量与计算维管束、导管面积、表皮厚度、皮层厚度等，每个处理选取3个样本，每个样本随机取10个视野求平均值，并记录导管数量[18]。

1.3.3自毒效应敏感指数(The allelopathic response index，RI)，采用Williamson[32]公式

RI=(T-C)/T(T≥C)或RI=(T-C)/C(T

其中C为对照值，T为处理值，当RI>0时，为促进作用；当RI<0时，为抑制作用，RI绝对值的大小表示自毒作用强度。

自毒综合效应((The synthetical autotoxicity effects，SE)：表示自毒作用的综合效应，SE是供体对同一受体多个测试项目的自毒效应敏感指数RI的算术平均值[33-34]。

1.4 数据分析

用Excel 2010应用软件进行数据整理，并制作图表；采用SPSS 19.0统计软件进行数据统计分析，采用Duncan法进行显著性比较；采用Photoshop CS 8软件进行图片合成。

2 结果与分析

2.1 外源香豆素和咖啡酸对苜蓿幼苗根系形态建成的影响

2.1.1对苜蓿幼苗根长的影响 由图1可以看出，与对照相比，紫花苜蓿总根长在高于5 mg·L-1的C处理和高于50 mg·L-1的CF及M处理下显著降低(P<0.05)。紫花苜蓿根长随着C处理浓度的升高而降低，50 mg·L-1和500 mg·L-1处理与对照相比分别降低18.78%和82.35%，差异显著(P<0.05)。CF处理浓度在0～50 mg·L-1范围内，紫花苜蓿总根长随着处理浓度的升高而增长，但与对照相比差异不显著(P>0.05)，当其处理浓度增至500 mg·L-1时，苜蓿幼苗根系严重发黑、干枯、腐烂。当M处理浓度为0.5 mg·L-1时，苜蓿根系总长与对照相比提高11.09%，但差异不显著(P>0.05)，总根长随着处理浓度的升高而降低，当处理浓度增至500 mg·L-1，总根长显著降低(P<0.05)，比对照降低61.63%。

2.1.2对苜蓿幼苗根表面积的影响 C，CF及M处理对紫花苜蓿根表面积的抑制作用在高浓度下更明显(图2)。当处理浓度低于50 mg·L-1时，3种外源添加物对苜蓿幼苗根表面积的抑制作用不明显，与对照相比差异均不显著(P>0.05)，当添加物浓度增至500 mg·L-1，C，CF及M处理下苜蓿幼苗根表面积与对照相比分别降低45.77%，22.47%和42.34%，均差异显著(P<0.05)。综上，500 mg·L-1及以上浓度的香豆素、咖啡酸及其混合物处理显著抑制紫花苜蓿根表面积的增加。

图1 香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿总根长的影响Fig.1 Effects of coumarin and caffeic acid on the total root length of alfalfa注：不同小写字母注释添加物与对照间差异显著(P<0.05)。下同Note:Different small letters indicate significant difference between additions and controls at the 0.05 level. The same as below

图2 香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿总根表面积的影响Fig.2 Effects of coumarin and caffeic acid on the total root surface area of alfalfa

2.1.3对苜蓿幼苗根体积的影响 如图3所示，紫花苜蓿根体积在高浓度C，CF处理下与对照相比显著降低(P<0.05)，低浓度处理下与对照相比差异不显著(P>0.05)，M处理紫花苜蓿根体积生长的趋势呈现出明显的低促高抑，C处理的浓度为50 mg·L-1时，紫花苜蓿根尖发黑、根变形严重、增粗、体积最大，但与对照相比差异不显著(P>0.05)，当其处理浓度增至500 mg·L-1时，其根严重受损，体积显著低于对照71.15%(P<0.05)。CF处理浓度为50 mg·L-1及以上时，紫花苜蓿的根体积比对照降低了34.23%，差异显著(P<0.05)。M处理下，0.5 mg·L-1的浓度处理使紫花苜蓿根体积比对照增加了45.79%，差异显著(P<0.05)，但其根体积随着处理浓度的升高而减小，当其处理浓度增至50 mg·L-1时，根体积比对照降低了26.17%，差异显著(P<0.05)。综上，CF和M处理抑制苜蓿根体积增大的临界浓度是50 mg·L-1，C处理是500 mg·L-1，但C处理的苜蓿根在50 mg·L-1浓度下，严重畸形、增粗、表皮粗糙甚至破裂，不利于苜蓿根系正常生长。0.5 mg·L-1的M处理显著促进了苜蓿根体积增加。

图3 香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿根体积的影响Fig.3 Effects of coumarin and caffeic acid on the root volume of alfalfa

2.1.4对苜蓿幼苗根尖数的影响 与对照相比，高浓度的C和CF处理显著降低了苜蓿的根尖数，M处理对苜蓿根尖数表现出低浓度促进，高浓度抑制趋势(图4)。C处理下，50，500 mg·L-1的浓度处理使苜蓿根尖数比对照分别降低了40.47%和90.15%，差异均显著(P<0.05)。CF处理下，500 mg·L-1的浓度处理使苜蓿根尖数比对照降低了56.5%，差异显著(P<0.05)，其余处理与对照差异均不显著。M处理下，0.5 mg·L-1的浓度处理使苜蓿根尖数比对照增长了42.67%，随着处理浓度的增加，根尖数逐渐减少，当处理浓度增至500 mg·L-1时，根尖数比对照减少了67.03%，差异显著(P<0.05)。综上所述，高于50 mg·L-1的C处理和高于500 mg·L-1的CF，M处理均显著抑制苜蓿根尖数的增长，而0.5 mg·L-1的M处理显著增加了苜蓿根尖数，促进苜蓿根尖生长。

图4 香豆素、咖啡酸对紫花苜蓿根尖数的影响Fig.4 Effects of coumarin and caffeic acid on the number of alfalfa root tip

2.2 外源香豆素、咖啡酸对苜蓿幼苗根系解剖结构的影响

2.2.1对根粗的影响 由图5可知，C，CF和M处理在低浓度时，对苜蓿根直径的增加有一定的促进作用，高浓度处理时均表现出显著的抑制作用。C处理下，随着处理浓度的逐渐增大，苜蓿根直径逐渐增大，50 mg·L-1的浓度处理时，苜蓿根直径比其对照增长了14.56%，差异显著(P<0.05)，但根畸形增粗，表皮粗糙甚至破裂。当其浓度增至500 mg·L-1时，根严重受损，干枯，腐烂严重，根直径减小，显著低于对照处理(P<0.05)。CF处理下，50 mg·L-1及高于该浓度作用时，苜蓿的根直径明显减小，比对照降低12.03%，且差异显著(P<0.05)。M处理下，0.5 mg·L-1的浓度处理明显促进苜蓿根直径增长，使其根直径比对照增加9.89%，随着处理浓度的增加，苜蓿根直径逐渐降低，当其浓度增至50 mg·L-1时，苜蓿根直径直线下降，比对照显著降低20.52%(P<0.05)。综上，CF和M处理抑制苜蓿根粗增大的临界浓度是50 mg·L-1，C处理是500 mg·L-1，但C处理的苜蓿根在50 mg·L-1浓度作用下，严重畸形、增粗、表皮破裂严重。500 mg·L-1浓度处理下，C，CF和M处理的苜蓿根直径均显著降低。

图5 香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿根粗的影响Fig.5 Effects of coumarin and caffeic acid on the root diameter of alfalfa

2.2.2对根皮层发育的影响 C，CF和M处理作用于苜蓿根系，根皮层厚度呈现低浓度降低高浓度增加的趋势，与皮层厚度与根半径之比的变化趋势基本一致，但不同处理间存在差异性(图6)。C处理下，50 mg·L-1浓度时，皮层厚度显著增大，皮层细胞排列紧密，比对照增加2.94%，且差异显著(P<0.05)，500 mg·L-1浓度处理的皮层厚度与根半径之比最大，比对照高14.75%，且差异显著(P<0.05)。CF处理下，50 mg·L-1浓度时，皮层厚度与根半径之比显著高于对照，当处理浓度增至500 mg·L-1时，苜蓿皮层厚度、皮层厚度与根半径之比均最大，分别比对照提高31.81%和61%，且差异显著(P<0.05)。M处理下，500 mg·L-1浓度时，苜蓿皮层厚度、皮层厚度与根半径之比分别比对照提高25.88%和37.11%，差异显著(P<0.05)，0.5 mg·L-1浓度时，皮层厚度与根半径之比显著低于对照(P<0.05)。可见，紫花苜蓿在较高浓度的自毒物质香豆素、咖啡酸和混合物作用下，增加根部皮层厚度抵制外源添加物的抑制作用，进而调节自身生长和发育。C处理使根皮层厚度明显增加的临界值为50 mg·L-1，CF和M的临界值为500 mg·L-1，表明在较高浓度处理时，C处理对苜蓿根皮层的抑制作用高于CF和M处理近10倍。

2.2.3对根系中柱发育的影响 3种外源添加物浓度低于5 mg·L-1的处理对苜蓿根中柱直径的影响均不明显，但导管数量及面积因外源添加物的种类不同呈现出不同的规律，随着添加物浓度的增加，苜蓿根中柱直径、中柱直径与根直径之比均呈现明显降低的趋势(图7)。C处理下，添加物浓度为50 mg·L-1时，导管数量增加25.89%，中柱直径与根直径之比降低，均与对照差异显著(P<0.05)。CF处理下，添加物浓度为5 mg·L-1时，导管数量和导管面积比其对照分别提高了36.84%和33.4%，且差异显著(P<0.05)，当浓度增至50 mg·L-1时，其根中柱直径，中柱直径与根直径之比较对照分别显著降低33.81%和24.65%(P<0.05)，但导管数量和导管面积与对照差异不显著(P>0.05)。M处理下，添加物浓度为0.5 mg·L-1时，苜蓿根中柱直径、导管数量和导管面积均最大，较其对照分别增加26.4%，35.2%和37.49%，显著高于对照。当其处理浓度增至50 mg·L-1及以上时，苜蓿的根中柱直径、中柱直径与根直径之比及导管数量均显著低于对照处理(P<0.05)，可见，低浓度(0.5 mg·L-1)的M处理明显促进了根中柱内导管的发育，使根变粗、根系发达。综上所述，当3种外源添加物浓度为50 mg·L-1时，苜蓿根中柱直径与根直径之比均显著降低，C处理的导管数量显著增加，CF处理导管面积显著增加，M处理的导管数量和面积均显著降低。

图7 香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿根中柱的影响Fig.7 Effects of coumarin and caffeic acid on the root stele of alfalfa

2.3 外源香豆素、咖啡酸对苜蓿幼苗根系形态建成和解剖结构的自毒及综合效应

如表2所示，香豆素、咖啡酸及其混合物对苜蓿根外部形态和内部解剖结构的自毒效应不同，同种外源添加物对苜蓿根外部形态和内部解剖结构的自毒作用强度与浓度密切相关。C处理下，0.5 mg·L-1浓度时，苜蓿根外部形态(总根长除外)、内部解剖结构(导管数除外)的RI>0，表明0.5 mg·L-1的C处理对苜蓿总根表面积、根体积、根尖数、根粗、中柱直径/根直径及导管面积的发育均有促进作用。添加物浓度在5～50 mg·L-1时对苜蓿根粗和导管数量与对照相比有显著促进作用，但对总根长和根尖数有显著抑制作用(P<0.05)。CF处理下，5 mg·L-1及低于该浓度时，苜蓿根外部形态(根尖数除外)的RI>0，5 mg·L-1浓度处理时苜蓿内部解剖结构的RI>0，表明较低浓度的CF作用下，除根尖数外，苜蓿根外部形态，各项指标均得到促进，5 mg·L-1时苜蓿内部解剖结构的各项指标均得到促进；50 mg·L-1浓度时，对苜蓿根体积、根粗及中柱直径/根直径与对照相比有显著抑制作用，对导管数和导管面积有显著促进作用(P<0.05)。M处理下，5 mg·L-1及低于该浓度时，对苜蓿根外部形态和内部解剖结构均表现为促进作用，其中对苜蓿根体积、根尖数、根粗和导管数的促进作用与对照相比差异显著，50 mg·L-1及高于该浓度时，对苜蓿根外部形态和内部解剖结构均表现为抑制作用，其中对苜蓿根体积、根粗、中柱直径/根直径及导管数与对照相比呈现出显著抑制作用(P<0.05)。当外源添加物的浓度增加至500 mg·L-1时，C，CF和M处理苜蓿幼根均发黑，出现严重损伤和腐烂，显著抑制苜蓿根外部形态和解剖结构。综上所述，M处理对苜蓿幼根外部形态和解剖结构呈现出明显的低浓度促进、高浓度抑制的作用，C和CF处理整体呈现高浓度(500 mg·L-1)抑制的效应。

表2 香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿根系形态和解剖结构的自毒效应Table 2 Autotoxic effects of coumarin and caffeic acid on the root morphology and anatomical structure of alfalfa

注：*表示与对照之间差异显著，P<0.05

Note:* in the table indicate significant difference at the 0.05 level compared to the control

图8 ‘甘农9号’紫花苜蓿不同外源添加物处理下根解剖结构图Fig.8 Root anatomical structure photograph of 'Gannong No.9' alfalfa under different exogenous additives

图9 香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿根系形态(左)和解剖结构(右)的自毒综合效应Fig.9 Comprehensive autotoxic effects of coumarin and caffeic acid on the root morphology(left) and anatomical structure(right) of alfalfa注：图中不同小写字母表示C,CF和M处理间的差异性，P<0.05Note：Different small letters indicate significant difference among C,CF and M treatments at the 0.05 level

3种外源添加物对苜蓿根外部形态和解剖结构的生长发育均呈现出比较明显的高浓度抑制效应(图9)。当处理浓度为0.5 mg·L-1时，C和CF处理对苜蓿根外部形态具有一定的促进作用，M处理对苜蓿根外部形态和内部解剖结构具有明显的促进作用，且均与C和CF处理差异显著(P<0.05)。5 mg·L-1的CF和M处理均促进苜蓿根外部形态和内部解剖结构的生长和发育，但两者之间差异不显著，该浓度处理下C对苜蓿根外部形态发育表现出抑制作用。随着处理浓度的增加，CF和M对两类指标均表现出抑制作用，但50 mg·L-1的C处理对苜蓿根解剖结构具有促进作用，并与M处理差异显著，这主要是因为该处理下苜蓿根粗和导管数量明显增加所致，然而中柱内细胞排列混乱且存在畸形(图8)，反而不利于根对水分和养分的吸收，使其根长和根尖数显著低于对照(P<0.05)。当处理浓度增至500 mg·L-1时，3种添加物对苜蓿幼根各项指标的抑制效应最强，C，CF和M处理对苜蓿幼根外部形态的自毒综合效应指数分别为-0.73，-0.41和-0.58，对苜蓿根内部解剖结构的自毒综合效应指数分别为-0.46，-0.26和-0.42，其中C处理对苜蓿根各项指标的抑制效应显著强于CF处理，M处理对苜蓿根内部解剖结构的抑制效应显著强于CF。综上所述，3种外源添加物对苜蓿的根外部形态和内部解剖结构的自毒抑制综合效应由强到弱依次为：C处理>M处理>CF处理。

3 讨论

本研究结果表明，较高浓度(50 mg·L-1)外源香豆素、咖啡酸及其混合物处理苜蓿幼苗，其幼根皮层厚度及皮层厚度与根半径之比均有增加现象，可能是在该浓度处理下紫花苜蓿通过增加根部皮层厚度来抵制外源香豆素和咖啡酸对其抑制作用，进而调节自身生长和发育。植物木质部中的导管，主要起输导水分和支持作用，赵祥等[35]认为，导管大有利于植物体内水分运输从而抵御干旱逆境，50 mg·L-1浓度的CF处理下苜蓿中柱直径与根直径之比降低，但导管数量和面积均显著增加，可见，苜蓿在较高浓度外源咖啡酸作用下，可以通过增加导管的数量和面积来运输和筛选水分、无机盐，降低较高浓度咖啡酸对苜蓿的抑制作用，为自身正常生长提供保障。该结果与刘延吉等[36]研究的玉米(ZeamaysL.)可通过根内维管柱径向加粗、增加导管数量，以提高根的运输能力，适应低钾胁迫逆境的现象不完全一致，这可能是由于研究对象和外源添加物不一致所致。植物自毒作用的一个重要机制是自毒物质通过影响受体植物细胞有丝分裂来促进或抑制其生长发育[37]，香豆素、咖啡酸及其混合物能够促进或抑制苜蓿幼根的形态建成和解剖结构，可能也是通过干扰苜蓿根尖细胞有丝分裂所致，其影响机制还有待进一步研究。

植物形态结构与所处环境密切相关，为了能在不同的生境中生长和发育，植物往往呈现出不同的形态结构，这通常被认为是植物对特殊生境的演化适应。本研究表明在香豆素、咖啡酸及其混合物的种类和浓度综合作用下，紫花苜蓿生长早期根系内部解剖结构与外部形态的可塑性存在一定相关性：低浓度(0.5 mg·L-1)混合物处理不仅显著增大苜蓿根体积和根尖数量，提高根系向所处环境摄取自身所需营养物质的能力，而且显著促进苜蓿幼根皮层、中柱、导管等解剖结构的发育(P<0.05)，增强根系通气和输导水分、无机盐的能力，进而形成了高效吸收和运移的良性循环体系，但香豆素和咖啡酸处理对苜蓿根外部形态和内部解剖结构的促进作用与对照相比差异不显著(P>0.05)。在低于50 mg·L-1的浓度处理下，紫花苜蓿幼根通过改变根系外部形态建成及改善其内部输导组织结构来适应香豆素、咖啡酸及其混合物的刺激作用，确保幼苗正常生长发育，但高于该浓度处理时，苜蓿根系形态建成和解剖结构均受到显著抑制效应，且自毒抑制效应由强到弱均为：香豆素>混合物>咖啡酸。可见，香豆素和咖啡酸的混合物在低浓度时增强了单体香豆素和咖啡酸对苜蓿幼根外部形态及内部解剖结构的促进作用，高浓度时降低了单体香豆素对紫花苜蓿幼根外部形态和内部解剖结构的抑制作用，该现象可能是由于香豆素和咖啡酸之间存在一定协同作用，而这种协同作用可能和外源添加物种类及其组成密切相关，也可能是混合物刺激苜蓿分泌某种新物质所致，该现象产生的可能原因有待进一步研究。

4 结论

苜蓿的根系外部形态和解剖结构对不同浓度香豆素、咖啡酸及其混合物存在相同或不同的响应机制：低浓度(0.5 mg·L-1)的香豆素和咖啡酸混合物处理对苜蓿幼根皮层、中柱、导管等解剖结构的发育呈现出显著的促进作用，增强单体香豆素和咖啡酸的促进作用。低于50 mg·L-1浓度的香豆素、咖啡酸及其混合物诱导紫花苜蓿根系产生不同程度的结构性改变以适应生长环境，但高于该浓度时，其根系受损严重，不能正常生长和发育。高浓度(500 mg·L-1)香豆素、咖啡酸及其混合物对苜蓿幼根外部形态和内部解剖结构的自毒抑制综合效应由强到弱依次为：香豆素>混合物>咖啡酸。本研究从根系形态建成和解剖结构层面解释了紫花苜蓿主要自毒物质香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿幼苗生长和发育的自毒作用，为深入探讨香豆素和咖啡酸对紫花苜蓿生长和发育影响机理提供依据。