不同利用方式对内蒙古羊草草原氨氧化微生物丰度的影响

时间：2024-07-28

朱蕊，陈清，马成仓，王中良

(1. 天津师范大学天津市水资源与水环境重点实验室，天津 300387；2. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387)

羊草(Leymuschinensis)草原是北方典型草原区和草甸草原区的重要草地资源类型之一，具有重要的生态功能和经济价值[1]。目前，由于人类对草地的不合理利用，改变草原生态系统的营养物质循环(如氮素循环[2])，造成营养物质流失和草原的大面积退化[3-4]。围封作为退化草地恢复的一种重要手段在草原区得到广泛应用[5-6]。草地管理方式改变如何影响氮素的生物地球化学循环，进而影响草原生态系统功能是一个广泛关注的问题。硝化作用在地球氮素循环中具有重要作用，是固氮和反硝化作用的中心环节，它决定了氮素对植物的有效性[7]。氨氧化过程是将氨氧化为亚硝酸的过程，是硝化作用的第一步也是限速步骤，由氨氧化微生物氨氧化古菌(Ammonia-Oxidizing Archaea，AOA)和氨氧化细菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria，AOB)完成[8]。草地利用方式的改变会影响AOA和AOB丰度，进而影响硝化作用和土壤氮素周转，国内外学者针对放牧和围封对氨氧化微生物的影响开展了研究，结果表明不同的草地利用方式会对氨氧化微生物产生不同的影响[9-10]。在内蒙古荒漠草原长期围封处理后AOB丰度显著增多，而AOA丰度对于土地利用变化的响应不明显[9]。德国西南部士瓦本山(Schwabische Alb)草原的研究发现，AOB非常稳定不受土地利用强度的影响，而AOA受土地利用强度的影响显著[10]。土地利用方式改变后，草原土壤硝化潜势和氨氧化微生物如何变化，不同研究区域由于环境因子差异，研究结果不尽相同。目前，内蒙古羊草草原大部分研究集中在放牧对氨氧化微生物的影响方面[11-12]。研究发现AOA随着放牧强度的增加而显著增加，而AOB的丰度在不同措施下都无显著变化[11]。也有研究发现AOB丰度随着放牧强度的增加显著下降，放牧对AOA丰度无显著影响[12]。目前，长期围封对内蒙古羊草草原氨氧化微生物丰度和硝化潜势的影响的研究鲜见报道。因此，本试验以内蒙古羊草草原为研究区域，通过分子生物学研究方法，研究不同利用方式下氨氧化微生物丰度和硝化潜势的变化趋势，探究围封后土壤中硝化过程转变的微生物机制，研究结果对于理解草地围封管理对于氮素周转影响的机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

土样采集于2015年8月8日，采样地点位于内蒙古草原生态系统定位研究站羊草样地北侧，锡林河流域中部(43°26′～44°29′N，115°32′～117°12′E)。该地区是温带典型草原，属于半干旱草原气候；年平均气温为0.7℃，冬季寒冷干燥，夏季温暖湿润；年平均降水量343 mm，降水集中于5-9月份，占全年降水量的80%左右，且降水的年际变化显著。土壤为暗栗钙土，土壤含水量为7.31%，pH为7.35～7.96，全氮含量为1.34 g·kg-1，铵态氮含量为2.18 mg·kg-1。植被以相对生物量为18%的羊草(Leymuschinensis)、34%的大针茅(Stipagrandis)、17%的糙隐子草(Cleistogenessquarrosa)、13%的冰草(Agropyroncristatum)等为主[13]。

1.2 试验设计与样品采集

试验设放牧和围封2个处理。从2005年开始选择地势平坦、植被均匀有代表性的样地进行围封，围封面积为0.2 ha，该围封样地是课题组长期水分、氮素添加的野外试验基地[14]，该样地在2005年之前进行了30年的连续放牧，放牧的强度约为2只羊·ha-1，并且此样地未曾施用过任何肥料。本试验的围封处理是长期定位野外试验样地的对照处理，即不加水不加氮的单围封处理。围栏内单围封不加水和氮处理设有4个小区(即4个重复)，每个小区面积5 m×8 m。该样地在围栏外仍然继续全年完全自由放牧，为本研究的自然放牧处理。2015年8月中旬进行土样采集，围栏内在单围封的4个小区采集土壤样品，与围栏内对应，围栏外自由放牧处理随机选择4个样点，即4个重复。围栏内每个小区和围栏外每个采样点使用直径为2 cm的土钻随机取0～15cm的土壤5钻，5钻混为一份样品，过2 mm筛，混合均匀，采用“四分法”选取部分土壤，装入封口袋中密封，围栏内外一共取40钻土，混合为8个土样(围栏内外各4个)。土壤进行分装，用生物冰袋冷藏，一部分鲜土带回实验室-80℃冷冻用于土壤总DNA的提取，一部分鲜土4℃保存用于硝化潜势的测定。

1.3 指标测定

1.3.2土壤总DNA提取和PCR扩增土壤总DNA提取采用FASTDNA®SPIN Kit for soil(Q BIOgene Inc.，Carlsbad，CA)，取500 mg土壤样品，操作过程完全按照试剂盒说明书进行。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA片段大小。氨氧化微生物选用amoA功能基因特异引物(表1)。PCR反应体系为20 μL，其中，正反引物各0.5μL，10×buffer 2 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板1 μL，用ddH2O 15 μL。

1.3.3克隆文库构建 PCR扩增产物进行切胶纯化，将纯化后产物与pGEM-T载体连接，再通过热激法将载体转化入感受态大肠杆菌细胞(JM109)(TaKaRa,Dalian)，取转化液涂布到含有氨苄青霉素(Ampicillin)的LB(Luria-Bertani)培养基上，37℃下培养16～18 h。进行蓝白斑筛选，选取大约100个白色克隆用的通用引物M13F和M13R进行菌落PCR扩增，将阳性克隆菌液送上海美吉公司进行测序分析。重组质粒测序结果经GenBank的Blast比对,分别与已发表的AOA和AOB氨单加氧酶amoA基因序列进行多重序列比对。表明重组质粒可以作为氨氧化微生物进行绝对荧光定量PCR分析的标准DNA。

1.3.4氨氧化微生物丰度的测定采用实时荧光定量PCR测定土壤氨氧化古菌和细菌(AOA和AOB)的丰度，对氨氧化微生物的氨单加氧酶活性多肽位点基因(amoA基因)进行定量分析。其定量PCR均采用SYBRGreen法。AOA和AOB定量均采用定性分析所用引物(表1)。扩增体系为20 μL，包含：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL,正反向引物各0.5 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 7 μL。采用ABI 7500实时定量扩增PCR仪，对氨氧化微生物进行定量分析。试验设置阴性对照，并将已知拷贝数的质粒DNA梯度进行稀释，得到标准曲线，每个样品3次重复，标线和样品的溶解曲线为单一峰。

注：F为上游引物，R为下游引物

Note：F is upstream primer and R is downstream primer

1.4 数据处理与统计

数据采用Origin 8.6进行数据分析与作图，SPSS 17.0软件对各指标进行独立样本T检验和相关性分析检验不同处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同利用方式对氨氧化微生物丰度和硝化潜势的影响

自然放牧状态下，AOA-amoA基因拷贝数为每克干土3.4×108个，AOB-amoA基因拷贝数为每克干土1.17×106个，AOA丰度显著高于AOB的丰度(图1)。与自然放牧相比，围封后AOA丰度显著下降(P<0.01)，下降了46.5%，而AOB丰度没有显著变化(P>0.05)，围封后AOA丰度仍高于AOB丰度。与自然放牧相比，长期围封显著降低土壤的硝化潜势(P<0.05，图2)。

图1 不同利用方式对AOA和AOB丰度的影响Fig.1 Effects of land use pattern changes on abundance of AOA and AOB注：图中误差线表示标准误差，不同小写字母代表放牧与围封处理间差异显著(P<0.05)。下同Note:The error bar in the figure represents standard errors,and different lower-case letters represent significant differences between graze and exclosure treatments (P<0.05). The same as below

图2 不同利用方式对硝化潜势的影响Fig.2 Effects of land use pattern changes on potential nitrification rate

2.2 硝化潜势与AOA和AOB丰度的关系

3 讨论

本研究结果显示内蒙古羊草草原长期围封后，土壤硝化潜势和AOA丰度显著下降，AOB丰度则无显著变化(图1，图2)；硝化潜势与AOA丰度呈显著正相关关系，与AOB丰度没有显著性相关(图3)，内蒙古羊草草原AOA相较于AOB对草地利用方式改变的响应更敏感，硝化作用可能由AOA主导。相似的研究结果也在内蒙古典型草原发现，AOA随着草地利用方式(放牧和割草)的改变而发生显著变化，而AOB丰度在不同草地利用方式下都无显著变化[17]。在法国Theix地区的半天然放牧草地的研究中也发现AOA对草地利用的改变更敏感，围封休牧降低了AOA的丰度，反之，适当的放牧强度会增加AOA丰度，但是围封和放牧均没有对AOB产生显著影响[18]。

土壤理化性质是决定氨氧化微生物丰度对土地利用方式响应的重要因素[19]。在本研究中，AOA可能是决定硝化潜势的优势种群，可能的原因是：1)土壤pH。前人通过分子生态学稳定性同位素探测技术(DNA-SIP)，验证了AOA在酸性土壤(pH=4.9～7.5)中更易生存[20-22]，AOB更喜在碱性土壤(pH=8.3～8.7)中生存[23-25]。本研究中，土壤偏中性(pH=7.35)，AOA与硝化潜势呈显著正相关，AOA对草原利用方式改变的响应比AOB更敏感。相反，在土壤呈碱性(pH=8.12～8.27)的内蒙古四子王旗荒漠草原和武川县高原草原的研究表明，AOB丰度相较于AOA在长期围封处理后更敏感，而对AOA影响不显著[9,26]。2)土壤氮素。研究发现AOA更好的适应低氮低肥力的环境中，AOB更倾向于在高氮高肥力的环境中生存[27-28]。对我国北方4类土壤中氨氧化微生物的活性及对氨氧化的贡献研究发现，AOA普遍在氨氮含量较低的草原土壤中主导硝化作用，而AOB在氨氮含量较高的湿地土壤中主导硝化作用[28]。本试验中，土壤全氮和氨氮含量较低(全氮含量为1.34 g·kg-1，氨氮含量为2.18 mg·kg-1)，可能成为AOA主导硝化作用的重要原因。3)土壤水分。研究发现在旱地生态系统中，水的可利用性在氨氧化过程中起着重要作用，AOA比AOB更容易在干旱环境中生长[17,26]。因此，在中性土壤、低肥力和低水分的土壤环境中，内蒙古羊草草原AOA比AOB对土地利用类型变化更加敏感。土壤环境背景一定程度上决定了对硝化过程起主导作用的氨氧化微生物类型[26,28]，因此，草地不同利用方式与其他土壤环境因素的交互作用对内蒙古羊草草原的氨氧化微生物的影响还有待更加深入的研究。