内源激素变化及外源生长素对紫花苜蓿种子萌发过程的影响

宋佳琦， ，

(新疆农业大学草业与环境科学学院/新疆西部干旱荒漠区草地资源与生态省部共建教育部重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

已有对生长素(indole-3-acetic acid，IAA)的研究中，最先被发现的是生长素可以调节植物的向性生长，并在后续的研究中发现生长素具有调控组织分化[1]、器官的形态建成[2]、顶端优势[3]和花期[4]等多种功能。最近的研究表明，生长素在种子的休眠过程中起正向调控作用，因此生长素是第二类促进种子休眠的激素[5]。Wang等[6]和Liu等[7]在生长素调控种子休眠的研究中发现，转录因子ARF是种子休眠过程的关键调控因子，其中ARF10和ARF16是直接参与到种子休眠调控过程的两个关键ARF基因，这在分子水平上探讨了生长素调控种子休眠的机制。3-吲哚乙酸(3-Indole acetic acid，IAA)是应用最广并且生物活性最强的一种生长素[8]，在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和羊草(Leymuschinensis)种子的萌发试验中，IAA对种子萌发的调控作用表现为：低浓度促进种子萌发，高浓度抑制种子萌发，且植物对IAA浓度变化的响应因植物的种类不同而具有差异[9-10]；用IAA处理白三叶(Trifoliumrepens)种子后进行萌发试验，结果表明，用20mg·L-1的吲哚乙酸，可提高白三叶种子的萌发率，促进胚根、胚芽的生长[11]；用20mg·L-1的IAA处理林地铁线莲(Clematisflorida)种子，提高了种子萌发率，平均萌发时间也比对照短[12]。IAA在种子萌发时有重要的调控作用，并且外源IAA能影响种子的萌发。研究生长素对种子萌发的影响多数集中于模式植物或经济作物，但对饲草作物的研究较少，有关激素调控紫花苜蓿种子萌发的研究鲜有报道。

本研究以紫花苜蓿为材料，分析了紫花苜蓿种子在不同萌发时期的內源激素变化，及其与苜蓿种子萌发间的关系，并且通过外源IAA浸种处理，研究了外源IAA对紫花苜蓿种子萌发的影响，以期为研究苜蓿种子萌发过程中的激素调控作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为新牧4号紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Xinmu No.4’)，由新疆农业大学“西部干旱荒漠区草地资源与生态”省部共建教育部重点实验室提供。

1.2 萌发试验

从供试样品中随机选取子粒饱满，大小均匀的苜蓿种子(种子硬实率约为25%)，用10%的次氯酸钠消毒5 min，取出后用蒸馏水冲洗3次。取出后均匀放置在湿润的三层滤纸培养皿中，置于25℃恒温培养箱中，光照强度为60 μmol·m-2·s-1，光周期为12 h光照/12 h黑暗。用称量法及时补充蒸馏水，防止各培养皿中水势变动。共计12皿，每皿50粒种子。

根据种子萌发形态，在未萌发种子(M1)、露白种子(M2)、肧根长度1.0～1.2 cm种子(M3)、苗期种子(萌发第7天，M4)这四个时期取样，样品经液氮冷冻后放入-20℃冰箱中保存，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中内源激素脱落酸(abscisic acid，ABA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、生长素的含量。

1.3 外源生长素处理

从供试样品中随机选取子粒饱满，大小均匀的苜蓿种子，用10%的次氯酸钠消毒5 min，取出后用蒸馏水冲洗3次。将消毒后的种子分别浸泡在5、10、20、30 mg·L-1IAA处理液中2 h，以蒸馏水为对照(CK)，取出后均匀放置在浸透不同浓度IAA溶液的三层滤纸培养皿中，置于25℃恒温培养箱中，光照强度为60 μmol·m-2·s-1，光周期为12 h光照/12 h黑暗。每个处理3次重复，每皿50粒种子。用称量法及时补充蒸馏水，防止各培养皿中水势变动。

种子以胚根突破种皮2 mm左右为萌发标准，每天观察记录种子萌发数，第4天统计萌发势，第7天统计萌发率并测定苗长、根长及生物量。萌发结束后取样，每个处理取0.5～1 g幼苗子叶经液氮速冻后置于-20℃的冰箱中，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定子叶中ABA、GA3、IAA的含量，试剂盒由中国农业大学提供。根据以上数据统计下列指标。

萌发率(%)=(第7天萌发种子粒数/供试种子总粒数)×100% ；

萌发势(%)=(第4天萌发种子粒数/供试种子总粒数)×100% ；

萌发指数( GI )=∑( Gt/Dt )，式中：Gt为在不同时间的萌发数；Dt为萌发日数；

活力指数( VI )=萌发指数×苗长

1.4 数据分析

数据通过Excel 2010进行整理，使用Origin 8.0软件作图。采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析及Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 苜蓿种子不同萌发时期内源激素的动态变化

苜蓿种子萌发的不同阶段IAA含量在11.06～11.39 ng·g-1FW之间，M1到M2时期种子中IAA含量减少0.06 ng·g-1FW，M2到M4时期IAA含量逐渐增多并且M3到M4时期显著增加0.18 ng·g-1FW(P<0.05)。由表1可知，GA3含量变化幅度最大，随着苜蓿种子的萌发进程，种子中GA3含量逐渐上升，在M1到M2期间GA3含量显著升高，M2比M1时期增长1.75 ng·g-1FW(P<0.05)。ABA的含量变化是种子破除休眠的关键条件之一，ABA含量在M1到M3时期逐渐下降，M2较M1时期ABA含量显著下降0.35 ng·g-1FW(P<0.05)，但在M3到M4期间，ABA含量略有回升。

表1 不同萌发时期苜蓿种子中内源激素的含量Table 1 The content of endogenous hormones in different germination stages of alfalfa seeds

注：同行不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同

Note: Different letters in the same line indicate significant difference at the 0.05 level, the same as below

2.2 不同萌发时期苜蓿种子內源激素间的比值变化

苜蓿种子萌发期间种子中各內源激素含量上下浮动，同时各内源激素间的比例也有变化。从图1可以看出，IAA/ABA、GA3/ABA变化趋势相似，在苜蓿出苗期(M1至M2时期)大幅度上升。在生根期(M2至M3时期)IAA/ABA增长幅度大于GA3/ABA，M3到M4期间IAA/ABA与GA3/ABA下降幅度相似。在苜蓿种子萌发过程中內源激素间的比例呈现不同变化，ABA与GA3、IAA具有显著的拮抗作用。

图1 不同萌发时期苜蓿种子中IAA/ABA、GA3/ABA的变化Fig.1 Changes of IAA / ABA and GA3 / ABA in alfalfa seeds during different germination stages注：不同字母表示差异显著(P<0.05)Note:Different letters indicate significant difference at the 0.05 level

2.3 外源生长素(IAA)对苜蓿种子萌发后子叶中内源激素含量变化的影响

不同浓度IAA处理下，子叶中IAA、GA3、ABA的变化对不同浓度IAA的响应不同。如表2所示，子叶中IAA的含量随着处理浓度的增长逐渐增多，当处理浓度为30 mg·L-1时，子叶中IAA含量最大为12.15 ng·g-1FW且显著高于其他处理(P<0.05)，表明外源IAA浸种后，促进子叶合成IAA。

子叶中GA3含量呈现先升高后下降的趋势，当处理浓度为20 mg·L-1时，子叶中GA3的含量最大，显著高于对照(P<0.05)，但30 mg·L-1处理下与对照相比子叶中GA3含量减少0.36 ng·g-1FW。脱落酸的含量变化与赤霉素和生长素均不同，不同浓度IAA处理下，子叶中ABA变化呈波浪型，当IAA处理浓度为10 mg·L-1时，子叶中ABA含量最少为3.47 ng·g-1FW显著低于对照(P<0.05)。

表2 外源IAA处理后苜蓿子叶中内源激素的含量变化Table 2 The change in content of endogenous hormones in alfalfa cotyledons after treated with exogenous IAA/ng·g-1 FW

2.4 外源生长素(IAA)对紫花苜蓿种子萌发特性的影响

通过比较不同浓度IAA浸种对紫花苜蓿苗长和根长的影响可知，在IAA浓度为30 mg·L-1时，苜蓿的苗长比对照减少0.03 cm，但无显著差异，其它处理均显著高于对照(P<0.05)。根长对IAA的响应与苗长不同，不同处理的IAA均可促进根的生长。当IAA浓度为10 mg·L-1时，苗长及根长生长最好分别高于对照43.1%和22.5%，其次为20 mg·L-1的处理。由表3可知，随着IAA浓度的升高，根长、苗长及生物量呈现先增大再减小的趋势，表明苜蓿种子萌发后的根、芽生长对IAA响应较敏感，适宜浓度的IAA促进根和芽的生长，但高浓度的IAA会明显抑制芽的生长。IAA浓度为10 mg·L-1时，萌发率、萌发势均显著高于其他处理(P<0.05)，相比对照组的萌发率和萌发势分别提高了18.66%和31.81%，30 mg·L-1处理下种子的活力指数比对照下降了6.64%，10 mg·L-1和20 mg·L-1处理下活力指数及萌发指数显著高于对照(P<0.05)。综上所述，10 mg·L-1和20 mg·L-1的IAA可以促进紫花苜蓿种子的萌发，但浓度为30 mg·L-1时，种子的萌发参数均低于对照，不利于种子的萌发。

表3 不同浓度IAA处理下苜蓿种子萌发参数的变化Table 3 The change in germination parameters of alfalfa seeds after treated with IAA at different concentrations

3.1 苜蓿种子萌发不同时期内源激素的动态变化

种子萌发是植物生命活动开始的标志之一，在多种激素的协调下完成[13]，种子生理休眠的诱导[14]及终止[15]在多种内源激素的协调、拮抗作用下完成。种子萌发时地上及地下生长过程中内源激素的含量变化各不相同。研究已证实ABA可以抑制种子萌发、维持种子休眠[16-17]。在本研究中紫花苜蓿种子萌发时根系的生长过程(M1至M3时期)，种子中ABA含量逐渐下降，因为打破种子的休眠、胚根突破种皮均与ABA的含量有关。在种子萌发时首先需要吸胀，种子吸胀后，发生的重要现象之一就是ABA含量下降，并且ABA的敏感性降低，这是种子萌发的先决条件[18-19]。M3到M4时期过程中，ABA含量略有回升，可能是吸胀结束后，种子重新合成ABA，因为ABA能够增加液泡中糖的浓度，提高根系细胞吸取营养的能力，促进出苗[20]。

本试验中苜蓿种子萌发经历M1到M2时期时，ABA含量减少，GA3含量骤升，这与油茶(Camelliaoleifera)[21]、凤丹(TreePeony)[22]、重楼(RhizomaParidisYunnanensis)[23]等种子萌发过程中ABA与GA3含量变化相似。GA3促进种子萌发的作用在多种植物上已被证实[24]。在种子萌发时ABA与GA3表现出显著的拮抗作用[25]。在苜蓿种子萌发过程中GA3含量逐渐上升，这可能与GA3的大量合成有利于动员种子的储存物质和胚的扩张有关[26]，并且种子萌发时积累大量GA3可以促进软化屏障组织水解酶的表达，降低胚根突破种皮的机械阻力，利于种子萌发[27]。

有研究证实IAA与ABA在种子萌发时具有相似作用，均表现为正向调控种子休眠[5]。本研究中，苜蓿种子在M1～M2时期，IAA含量下降，表明苜蓿种子萌发时，种子休眠的解除受IAA和ABA共同作用。生长素在植物顶端组织和幼嫩叶片中合成[28]，低浓度的IAA促进植物的生长发育，浓度过高则抑制植物的生长。在苜蓿种子萌发后期，IAA含量逐渐增多，表明苜蓿地上和地下部分的生长需要合成IAA。

种子的萌发不仅受ABA、IAA、GA3等内源激素的调节，也与各内源激素间的平衡有关，特别是促进生长类激素与抑制生长类激素间的平衡[29]。本试验发现，苜蓿种子在不同萌发时期，GA3/ABA、IAA/ABA的比值整体升高，说明苜蓿萌发时激素间的平衡作用，对解除种子休眠，促进萌发有重要影响。Cadman[30]也认为GA/ABA值升高是种子解除休眠的原因，GA/ABA值呈上升趋势会打破种子休眠，促进种子萌发。

3.2 外源IAA对苜蓿种子萌发的影响

已有研究使用IAA浸种处理黄瓜(Cucumissativus)[31]、黑草(Buchneracruciata)[32]、蓝靛果忍冬(Loniceracaerulea)[33]等种子，发现IAA对种子萌发的影响，均呈现低浓度的IAA促进种子萌发及幼苗的生长，而较高浓度的IAA会降低种子的萌发率。本研究也得出了相似的结果，低浓度(10 mg·L-1)的IAA可促进紫花苜蓿种子的萌发，并且促进幼苗生长。外源IAA促进苜蓿种子萌发率及幼苗的生长，这与苜蓿种子萌发过程中内源激素的变化息息相关。种子萌发时GA和ABA表现为拮抗作用，ABA含量的下降是GA含量升高和敏感性增强的必要因素[34]。本研究中发现，随着IAA处理浓度递增，紫花苜蓿种子萌发时子叶中GA3含量逐渐增多，同时ABA含量逐渐减少，说明在外源IAA处理下，苜蓿种子萌发过程中GA和ABA依然有显著的拮抗作用。近期研究表明，ABA的含量变化取决于CYP707A2基因的活性[19]。在试验中通过IAA浸种后可能影响紫花苜蓿种子中CYP707A2基因的表达，导致子叶中ABA含量下降，促使GA的合成基因上调。

综上所述，外源激素IAA影响紫花苜蓿种子萌发时GA3、ABA含量，进而影响紫花苜蓿种子萌发。但激素的调控网络十分复杂，外源IAA如何影响苜蓿种子萌发时内源激素的调控网络，还有待进一步研究。