苜蓿斑点病病原菌分离鉴定及紫花苜蓿品种的抗性筛选

方 ， ，

(北京林业大学林学院，北京 100083)

紫花苜蓿有“牧草之王”的美称[1]，因其适应性、抗逆性及营养品质突出而在世界广泛栽培，在畜牧业中具有重要的作用。随着品种单一化以及规模化和集约化的生产，苜蓿的病害也越来越严重，其严重地降低了牧草的品质和产量[2]，造成了较大的经济损失[3]。苜蓿病害研究在我国起步较晚，直到上世纪70年代才开始进行系统的研究[4]，当前多种病害研究资料依然匮乏，因此，加强苜蓿病害研究是我国苜蓿安全生产的重要保障之一。

苜蓿斑点病可严重降低苜蓿产量和饲用价值，链格孢菌(Alternariasp.)是苜蓿斑点病的病原菌之一。Naseri等[5]2000年在Kheirabad对生长期具有斑点病症状的苜蓿进行了病原物分离，发现发病苜蓿植株的叶、茎、根等器官中均含有链格孢菌，并证明其可产生降低饲草品质的真菌毒素。链格孢菌作为苜蓿斑点病的病原菌的描述记载较多[6-7]，但国内的系统研究报道目前还较少。2010年，国内首次报道链格孢引起的苜蓿斑点病，并分离得到交链格孢(Alternariaalternata)[8]。由于链格孢属分生孢子的形态学特征易受外界环境影响，因此根据形态学观察难以对链格孢属进行种级分类；但随着分子生物学的发展，利用内转录间隔区ITS和 OPA2-1核苷酸序列对苜蓿斑点病链格孢属病原菌种一级的分子鉴定已有报道[9]。

目前，交链格孢菌斑点病尚无抗性品种育出，因此主要依赖化学防治[10]。抗病育种是防治病害提高牧草效益的核心手段之一。由于每一种病原物的致病机理都有其独特的遗传特性，则筛选出对应病原物的抗性材料是培育抗病品种的关键。抗病筛选的方法主要有孢子悬浮液接种法和离体叶片接种法，前者具有准确、快速的优点，后者便于控制环境条件且差异明显，都广泛地用于抗病性评价[11-12]。除接种方法外，抗病相关酶活性变化的生理指标也可用于抗病性评价[13]。苯丙氨酸解氨酶PAL是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，参与多种抗菌化合物的合成。多项研究表明PAL酶活性与抗病性呈正相关，因此苯丙氨酸解氨酶活性可用于抗病性评价[14]。

根据对北京林业大学顺义草地植物实验站中紫花苜蓿的病害调查，苜蓿斑点病发生极其严重，本研究对该实验站中苜蓿斑点病的病原菌进行了分离鉴定，并将其侵染21个紫花苜蓿品种，综合评价这些品种对该病原菌的抗病性，为我国苜蓿斑点病的抗病性研究奠定基础，也为生产中选择对苜蓿斑点病抗性强的苜蓿品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

2017年4月11日于北京林业大学八家试验地大田分区播种21个紫花苜蓿品种(表1)，进行常规田间养护。

表1 紫花苜蓿品种及编号Table 1 Alfalfa varieties and numbers

1.2 菌种材料

1.2.1采样及病菌分离 2017年6月于北京林业大学顺义草地植物实验站采集苜蓿典型病样，采用常规组织分离法[15]对病原菌进行分离，多次纯化获得纯菌株。

1.2.2病原菌分子鉴定 病原菌DNA提取利用试剂盒(OMEGA E.Z.N.ATM Fungal DNA Mini Kit)进行。 采用真菌核糖体内转录间隔区通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[16]、小分子链格孢特异引物OPA2-1R(5’-TGCCGA GCTGTCAGATAATTG-3’)和OPA2-1F(5’-GCCGAG CTGGTGGAGAGAGT-3’)[17]进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μl，DNA模板为1 μL，上下引物各1μL，ddH2O 9.5 μL。反应程序为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸5 min。

PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成，扩增产物送该公司测序，测序结果在NCBI数据库中进行登录和比对。

1.3 接种方法

采用孢子悬浮液接种，参考袁庆华[11]等方法并加以改良，用血球计数板计算孢子浓度，制成浓度约为1×106个·ml-1的孢子悬浮液。

1.3.1离体叶片接种 参考李洪建[18]关于苜蓿茎点霉叶斑病的离体叶片接种方法，并稍作修改。选取无病且长势良好的植株，以复叶为单位采集相同部位叶片，每个培养皿放置4片大小相似的复叶，每处理3皿，设3次重复。每天喷雾蒸馏水以保证培养皿内湿度。

1.3.2田间接种 选取长势一致、健康的苜蓿植株，采用孢子悬浮液喷雾接种，套袋遮光保湿24 h后去袋，对照喷雾等量蒸馏水，每处理10株，设3次重复。

1.3.3离体枝条水培接种 选取健康枝条于蒸馏水中水培，采用孢子悬浮液喷雾法接种，遮光保湿24 h后放置在27℃，80%湿度的光照培养箱中，于4天后取相同部位叶片测PAL酶活性。对照喷等量蒸馏水，设3次重复。

1.3.4病情测定

1.3.4.1 发病率

发病率的统计方法是发病叶片占总叶片的比例。每天观察发病情况。

1.3.4.2 分级标准

按每片小叶片病斑面积占总单片叶片面积的比例来分级测定病情。0级：无病斑；1级：病斑占叶片面积0～25%；2级：病斑占叶片面积26%～50%；3级：病斑占叶片面积51%～75%；4级：病斑占叶片面积76%～100%。

抗病级别实验室离体叶片实验病情指数<15为高抗，病情指数16～30为中抗，病情指数31～45为中感，病情指数>45为高感。

田间试验拟抗病级别病情指数<5为高抗，病情指数5～10为中抗，病情指数10～15为中感，病情指数>15为高感。

1.3.5酶活性测定 PAL测定方法参考陈建陨[19]的方法，以每30 min A290增加0.01所需酶量为1个酶活性单位(U·g-1)，使用UV-2600分光光度计测量。为了消除材料本身的差异和测量之间的误差，本试验所测定的酶活性采用相对酶活性：

相对酶活性(%)=接菌株系酶活性/未接菌株系酶活性×100%

1.3.6隶属函数计算方法 利用公式求出具体函数值，Zij为i苜蓿品种的j指标的隶属函数值，Xij为i苜蓿品种的j指标值，Xjmin、Xjmax分别为21个供试品种j性状指标的最小值和最大值。当j指标与苜蓿抗病性成正相关时，用(1)式；反之，当j指标与苜蓿抗病性成负相关时用(2)式。

Zij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin) (1)

Zij=(Xjmax-Xij)/(Xjmax-Xjmin) (2)

把21个品种大田实验测得的病情指数、离体叶片实验测得的病情指数和枝条水培取样测得的PAL酶活性指标的隶属函数值求平均值，值越大，抗性越强；反之越小。利用各品种指标隶属值的大小来评价其抗病性强弱。

1.3.7数据分析 应用Excel、SPSS 22.0软件对数据进行处理和作图，采用one-way ANOVA进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 苜蓿斑点病症状及病原真菌形态特征

经实地调查分析，6月初苜蓿斑点病发生极严重，病叶占整个植株近70%，且所有植株都感病，感病植株表现出活力减弱，叶片萎黄；病斑正反面均为黑褐色，融合扩大表现出与褪绿晕环绕的同心区，周围叶片黄化，表面平滑无凸出感，病斑直径为0.1～0.6 mm，且病斑所占叶片面积按病害严重程度递增，病情轻微的叶片仅叶尖发黄，严重时整个叶片发黄，对植株生长和苜蓿的品质造成极大影响。

对采集的病叶分离纯化，在PDA平板培养基上培养，菌落前期灰白色，后期呈墨绿色，有絮状气生菌丝，分生孢子梗单生或簇生，有分隔；在显微镜下观察分生孢子呈梭形、倒棍棒型、长卵型。有2～5个横隔，0～3个纵隔，大小约为20 μm×10 μm，隔膜处稍有缢缩。根据分生孢子的形态特征初步鉴定为链格孢属真菌(Alternariasp.)。

图1 苜蓿斑点病发病症状及病原形态特征Fig.1 The symptoms of alfalfa Leaf spot and morphology of isolated pathogen注：A：苜蓿斑点病病叶症状；B：病原菌落形态；C：病原菌分生孢子(400×)Note：A：The symptom of alfalfa leaf spot；B：Isolation and culture of pathogen；C ：Conidia(400×)

2.2 分子鉴定结果

以病原菌DNA为模板，分别用ITS1/ITS4引物和OPA2-1L/OPA2-1R引物做PCR扩增，电泳后紫外凝胶成像(图2)，条带单一较亮，且无非特异性扩增条带，将PCR产物进行双向测序。

图2 真菌基因组的DNA PCR检测电泳图谱Fig.2 Electrophoresis pattern of fungal genomic DNA PCR test

通过分析rDNA-ITS和rDNA-OPA2-1测序比对的结果，将得到的序列导入Genbank中进行同源性比对，并结合形态学特征确认致病菌是交链格孢菌(Alternariaalternata)。

扩增的ITS序列结果(547bp)：

A C C T G C G G A G G G A T C A T T A C A C A A A T A T G A A G G C G G G C T G G A A C C T C T C G G G G T T A C A G C C T T G C T G A A T T A T T C A C C C T T G T C T T T T G C G T A C T T C T T G T T T C C T T G G T G G G T T C G C C C A C C A C T A G G A C A A A C A T A A A C C T T T T G T A A T T G C A A T C A G C G T C A G T A A C A A A T T A A T A A T T A C A A C T T T C A A C A A C G G A T C T C T T G G T T C T G G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C G A A A T G C G A T A A G T A G T G T G A A T T G C A G A A T T C A G T G A A T C A T C G A A T C T T T G A A C G C A C A T T G C G C C C T T T G G T A T T C C A A A G G G C A T G C C T G T T C G A G C G T C A T T T G T A C C C T C A A G C T T T G C T T G G T G T T G G G C G T C T T G T C TC T A G C T T T G C T G G A G A C T C G C C T T A A A G T A A T T G G C A G C C G G C C T A C T G G T T T C G G A G C G C A G C A C A A G TC G C A C T C T C T A T C A G C A A A G G T C T A G C A T C C A C T A A G C C T T T T T T T C A A C T T T T G A C C T C G G A T C A G G T A G G G A T A C C C G C T G A A C T T A A G C A T A T C A

扩增的OPA2-1序列结果(599bp)：

C T G T C A G A T A A T T G A A G C T T T G A T G C T A A G A A A G T A G T T T A T T T G G T A T G A T G G T G G C T G T T G G G C G C A G C T A C C T T T A A G A A G G G T C C G C G A A G T T T A T G G C A A T G A G G T C A T G T C C G G T C T T T A C C G G C C A G C G C C A T T G T T G G G C G C G T C T C G T G C G A G T G C A T C G G G T G G A C G T G G G A C A C T G C A C C A T A G T A A C G C G A C G C G C T G C A T A C A C G C T G T T T G T C A G C C C A G G T G G C G T G A G G T A T C A G A T C T G C G G C G T G G T C T T G C T A C C G A A T G C G T G C G C T T G C A G C T C G A G G C T T C G T T T A C G C T C A C G A T T T T C T T C G T A C T A A C A C T G T T A T C G C G G C G T G G A A A T A A C T T G T A T C A A G C A C G A G A T T G T T G G T C A G A G T G G A A T C GA G A C A T T T G A A A G C G G G G C G C C T C G T G G G C C G T A C C A C T C C A T C C A C A T G T A T T T G G T C A A T C T G C A T C A T C A C C C G T C T A T C C A C A G C A G A A T C C C A A C A T T C A T C C A A G T C T G A A T T T T G C T A A T C A T A C A T C A G A A C G T G A A G A T C A C G A C C C A G C T C C C C G C A G C T T A T C T G C A G T C A T T T C C T G A A C T C T C T C C A C A A

2.3 离体叶片实验筛选

离体叶片侵染后2～3 d有明显发病叶片，8～10 d发病率趋于稳定，10 d后测定病情指数(图3)。

由图3可知，21份材料的病情指数为5.79～53.01；品种间存在显著差异(P<0.05)，病情指数越小抗病性越强，‘英斯特’病情指数5.79，抗病性最强，其次是‘SK3010’病情指数6.02，‘北林201’病情指数7.87，‘皇冠’病情指数8.10；抗病性最弱的为‘新疆大叶’，病情指数高达53.01，其次是‘准葛尔’病情指数50.46，‘维多利亚’病情指数40.05，‘肇东’病情指数38.43；将所有21个品种分为以下四个抗性水平，高抗水平(病情指数<15)的编号为：3，5，6，7，8，12，15，16，17；中抗水平(病情指数16～30)的编号为：2，1，4，9，10，11，13；中感水平(病情指数31～45)的品种编号为：14，18，21；高感水平(病情指数>45)的品种编号为：19，20。

图3 离体叶片实验不同苜蓿品种的病情指数Fig.3 Disease index of different alfalfa cultivars in vitro leaf experiments注：品种编号参考表1；不同小写字母间差异显著(P<0.05)；下同Note: Varieties number in Table1. Different small letters (P<0.05) are significant different among the treatment. The same as below

2.4 大田实验筛选

大田实验侵染一周后开始有病症叶片，20 d后病情明显测定病情指数(图4)。

由图4可知，21份材料的病情指数为0.49～29.75，品种间存在显著差异(P<0.05)。抗性最强的为‘威神’，病情指数0.49，‘皇冠’病情指数0.62，其次是‘SK3010’病情指数0.74，‘MF4020’和‘Tango’的病情指数均为1.11，最易感病的品种为‘新疆大叶’病情指数29.75，其次是‘耐盐之星’病情指数26.79、‘准葛尔’病情指数22.59。将所有21个品种分为以下四个抗性水平，高抗水平(病情指数<5)的品种编号为：2，3，5，6，7，8，13，14，15，16，17，18；中抗水平(病情指数5～10)的品种编号为：1，4，11，12，21；中感水平(病情指数10～15)的品种编号为：10；高感水平(病情指数>15)的品种编号为：9，19，20。

图4 大田实验不同苜蓿品种的病情指数Fig.4 Disease index of different alfalfa varieties in field experiments

2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性差异筛选抗感病

枝条水培实验的叶片侵染后4 d病症初现，各苜蓿品种叶片取样测苯丙氨酸解氨酶活性(图5)。

图5 不同品种侵染后四天苯丙氨酸解氨酶(PAL)相对酶活性Fig.5 Relative enzyme activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) in four days after infestation of different cultivars

由图5可知，品种间PAL相对酶活性存在显著差异(P<0.05)，其中‘英斯特’相对酶活性最强，达到136%；其次是‘MT4015’，相对酶活性达131%；相对酶活性较低的是‘巨能7’和‘新疆大叶’，分别为82%和84%；‘巨能601’相对酶活性居中为100%。

利用生理生化指标进行抗病性鉴定是一种辅助性鉴定方法，许多研究表明，植物受到病原菌侵染后，一些代谢相关酶会发生一定的变化，这些变化与植物的抗病机制有关。多项研究表明[20]，PAL活性与抗病性呈正相关，因此可利用PAL活性来测定品种的抗病性，即PAL酶活性越高，抗病性也较强。由图4可知，抗性较强(病情指数>110)的品种编号为：1，2，4，5，13，14，15，17，21；抗性中等(病情指数90～110)的品种编号为：3，6，7，9，11，12，16，19；抗性较弱(病情指数<90)的品种编号为：8，10，18，20。

2.6 利用模糊隶属函数法综合筛选

不同紫花苜蓿种质抗病强弱的程度可以通过隶属函数值反映，值越大植株受病原菌影响越小，其抗病性就越强；反之，隶属函数值越小，植株受病原菌影响越大，抗病性越弱。通过隶属函数法综合大田侵染实验的病情指数、离体叶片实验的病情指数和PAL相对酶活性指标进行了评价，对21个紫花苜蓿品种进行抗病性强弱的排序(表2)，抗性由强至弱分别为‘英斯特’>‘MT4015’>‘北林201’>‘Tango’>‘威神’>‘皇冠’>‘巨能995’>‘SK3010’>‘斯贝德’>‘Dryland’>‘MF4020’>‘巨能2’>‘巨能801’>‘巨能601’>‘巨能7-耐望’>‘维多利亚’>‘巨能7’>‘肇东’>‘耐盐之星’>‘准葛尔’>‘新疆大叶’。

3 讨论与结论

苜蓿有许多常见且危害严重的真菌病害，如霜霉病[21]、褐斑病[22]、锈病[23]、根腐病[24]等，近年来已有对这些病害进行了系统研究[25]。张丽[14]从苜蓿叶部病害分离到的苜蓿真菌中链格孢的分离频率最高，但是致病性较弱，因此该病菌引起的苜蓿病害易受研究者忽视。

2017年6月，本研究通过对北京林业大学顺义草地植物实验站紫花苜蓿的调查发现一种叶部病害发生严重，对苜蓿的品质和产量造成了极大的影响，通过发病叶片的病斑观察并结合显微镜下孢子形态观察，初步确定病原菌为链格孢属(Alternariasp.)，通过查阅文献确定该苜蓿病害为苜蓿斑点病[8-9]。传统的菌种鉴定方法易受到环境和人为因素的影响而表现不稳定且难以准确鉴定到种。真菌DNA碱基具有稳定性，借助PCR和测序等分子生物技术可以快速鉴定出真菌种类[25]。本实验利用试剂盒提取了真菌DNA，分别利用引物ITS1/ITS4和OPA2-1R/OPA2-1F扩增出真菌核糖体ITS片段(547 bp)和OPA2-1片段(599bp)，经过Genbank比对结果均为交链格孢(Alternariaalternata)。

利用分离培养的真菌进行田间侵染、实验室离体叶片法和水培枝条法侵染实验，苜蓿发病症状均相似，叶尖发黄，病斑大小视严重程度而异，发病严重的叶片黄化、变干脱落(室外大田)、叶片变薄透明(离体叶片)，采集病叶重新鉴定真菌，仍为交链格孢菌，利用柯赫氏法则保证了实验的准确性。本研究结合大田侵染实验和室内侵染实验，对21个紫花苜蓿品种对分离得到的链格孢做了抗性的初步研究，分析3种实验方法，大田侵染、枝条水培侵染、离体叶片侵染后叶片病症相似，但发病速度离体叶片>枝条水培>大田；离体叶片实验易于控制100%湿度和最适宜孢子生长的温度，3 d出现病症，10 d发病率趋于稳定；枝条水培实验控制80%的湿度和最适宜温度，4 d天侵染成功出现症状；大田实验视环境不可控因素影响未能达到最适发病条件，发病症状没有实验室条件控制下明显，一周之后叶片出现病症，病情指数低于实验室条件下病情指数，但是大田侵染更接近自然发病条件，对于生产应用有直观的参考价值。

寄主植物与病原真菌的相互作用具有复杂性，利用生理生化指标可作为抗病性评价的辅助性方法。本实验利用苯丙氨酸解氨酶活性作为指标参与抗病性评价。结果表明各苜蓿品种PAL酶活性存在显著差异(P<0.05)，与大田实验和离体叶片实验的病情指数评价抗感病结果存在极大相似度。

由于3种实验的影响因素不同，所造成评价苜蓿抗病性的影响差异还有待研究。3种指标所占的权重无法准确衡量，利用模糊隶属函数法，对3个指标隶属值求平均来综合评价21个紫花苜蓿品种的抗病性强弱，抗性最强的是加拿大进口的英斯特品种，抗性最弱的是本土新疆大叶品种，为生产中选择对苜蓿斑点病抗性强的苜蓿品种提供了参考。此外，多品种的抗性差异，为深入研究紫花苜蓿对苜蓿斑点病的抗感机理奠定了基础，有利于今后深入研究抗病机理，减小链格孢菌产生的霉菌毒素和植物毒素对苜蓿生产造成的危害。