60Co-γ射线辐射对苜蓿根茎叶显微结构的影响

李 ，

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室， 黑龙江 齐齐哈尔161006)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是最有价值的栽培牧草之一，世界各地广泛种植，根系发达，主根粗大，抗逆境和可再生能力较为强大，产草量高，富含蛋白质，适口性好，固氮能力强，是我国人工种植面积最大的豆科牧草[1-2]，在我国生态环境建设、生态修复方面起着重要的作用[3]。

60Co-γ射线辐照是最为有效的人工诱变育种方法之一，目前国内外关于牧草的γ射线辐射诱变育种工作广泛展开, 主要集中对牧草品种对射线的辐照敏感性、育种的适宜剂量及其辐射诱变规律的研究[4-6]。植物体的形态结构和生理功能是统一的，功能的差异必然与相应的器官结构紧密相关[7]。利用60Co-γ射线辐照研究其对植物显微结构的影响的研究甚少，如李黎等利用60Co-γ辐射对两个不同品种菊花的叶片组织结构的影响进行研究，通过电镜观察发现，辐射后植株叶片的栅栏组织的排列比对照植株排列疏松，栅栏组织细胞层数增多[8]。本文研究了60Co-γ辐射苜蓿根茎叶等营养器官的生理结构的影响，以期为利用60Co-γ射线辐照选育苜蓿新品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为黑龙江省畜牧研究所提供的‘龙牧806’苜蓿干种子，其具有耐寒、耐盐碱，高产等特性，适合在低温及盐碱地上栽种。

1.2 研究方法

1.2.160Co-γ射线辐射处理60Co-γ辐射源由中国农业科学研究院原子能利用研究所提供，辐射剂量依次为600，900，1 200，1 500 和1 800 Gy共5个剂量，剂量率15 Gy·min-1，每份处理50 g种子，以同一批次相同数量未经处理的种子作为对照(CK)。

1.2.2幼苗的培养 取5种剂量的60Co-γ(600，900，1 200，1 500和1 800 Gy)射线辐射处理和未辐射的苜蓿种子，采用土培的方法将其种植在营养钵中(针叶土、营养土和珍珠岩按1∶2∶0.5比例进行混合)，1 800 Gy辐射剂量的苜蓿种子虽然能出苗，但在培养期间逐渐死亡，其它辐射剂量和对照的苜蓿幼苗待生长至三叶一心期后备用。

1.2.3显微结构样品的制备与观测 45 d后分别剪取各处理植株根、茎、叶材料，根部为成熟区的相同部位，茎采集第3叶位的茎段，叶片取第3叶位三出复叶中间小叶的中部[7]，叶片中部叶脉为中心横切成大小为5 mm×7 mm的小块，根、茎切成1 cm长的小段。立即用福尔马林-乙酸-乙醇固定液(FAA)固定，1%番红水溶液染色2 h，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度为8～12 μm，用0.5%固绿复染，中性胶封片，于Motic-MODEL-BA300LE显微镜下观察和摄影，每个处理样本随机取10个视野求平均值。

1.3 数据分析

栅海比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度

叶片栅栏组织结构紧密度(CTR)=(栅栏组织厚度/叶片厚度)×100%

叶片海绵组织结构疏松度(SR)=(海绵组织厚度/叶片厚度)×100%

利用Excel 2010对数据进行整理，采用SPSS 17.0中单因素方差分析(one-way ANOVA)对植物组织结构特征指标进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 60Co-γ射线辐射对苜蓿根显微结构的影响

苜蓿根的显微结构包括表皮、皮层、维管柱组成(图1)。在不同剂量的60Co-γ辐射处理下，苜蓿根的直径、皮层薄壁细胞的厚度、表皮的厚度、维管柱的直径、原生导管及后生导管的直径均会产生不同程度的影响。当辐射剂量为1 500 Gy时，苜蓿根的厚度、皮层薄壁细胞的厚度、表皮的厚度，维管柱的直径、原生导管及后生导管的直径均达到最大值。

不同辐射剂量处理下苜蓿根的表皮和皮层厚度、根、导管和维管柱直径均随着辐射剂量的增加呈现上升变化趋势(表1)，当辐射剂量为600和1 500 Gy时，根表皮的厚度比对照组增加了34.32%和111.9%，根皮层厚度比对照组增加了12.27%和39.39%，根直径比对照组增加了36.05%和209.87%，根原生导管的直径比对照组增加了14.03%和137.19%，后生导管的直径比对照组增加了39.29%和129.44%，根维管柱直径比对照组增加了41.00%和251.29%。低剂量与高剂量之间苜蓿根的表皮厚度、皮层厚度、根直径、原生导管直径、后生导管直径和维管柱直径均差异显著(P<0.05)。辐射对根的维管柱直径和根厚度影响最大，其次为原生导管直径、后生导管直径和表皮厚度，对皮层厚度影响最小。

表1 60Co-γ处理下苜蓿种子的幼苗根显微结构的特征Table 1 Root structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

注：同列不同小写字母表示差异显著, 下同

Note: Different small letters in the same row indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

图1 60Co-γ射线辐射苜蓿种子的幼苗根解剖结构Fig.1 Roots anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：图中1，2，3，4和5依次为辐射剂量0,600,900,1 200和1 500 Gy时根的显微结构(×40)；6，7，8，9和10依次为辐射剂量0,600,900,1 200和1 500 Gy时根的显微结构(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of the root were in the order of radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500 Gy (×40), and the 6, 7, 8, 9 and 10 micrographs of the root were in the order of radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500 Gy (×400)

2.2 60Co-γ射线辐射对苜蓿茎显微结构的影响

茎的显微结构由表皮、皮层、维管束和髓组成(图2)。在不同剂量的60Co-γ射线辐射处理下，苜蓿茎的表皮和皮层薄壁厚度、维管束和髓直径均会产生不同程度的影响。当辐射剂量达1 500 Gy时，苜蓿茎的表皮厚度、皮层薄壁厚度、维管束直径、髓直径均达到最大值。

经过不同辐射剂量处理后，苜蓿茎的表皮和皮层薄壁细胞厚度及维管束直径和髓直径均产生不同程度的变化(表2)。当辐射剂量为600和1 500 Gy时，其茎的表皮厚度与对照组比较增加了23.23%和59.01%，皮层薄壁细胞厚度与对照比较增加了1.74%和24.48%，维管束直径与对照比较增加了9.95%和52.72%，髓的直径与对照比较增加了20.42%和69.07%。除600和900 Gy辐射剂量外的皮层薄壁细胞厚度外，其它辐射剂量的苜蓿茎的表皮厚度、皮层薄壁厚度、维管束直径、髓直径与对照比较均差异显著(P<0.05)，特别是高辐射剂量对苜蓿茎的显微结构的影响更大。辐射对茎的表皮厚度、维管束直径和髓的直径影响比较大，对皮层薄壁细胞厚度影响最小。

2.3 60Co-γ射线辐射对苜蓿叶片显微结构的影响

叶的显微结构由上下表皮、叶肉和叶脉组成(图3)。在不同剂量的60Co-γ射线辐射处理下，苜蓿叶片的上表皮、下表皮、叶片、栅栏组织、海绵组织脉凸起厚度均会产生不同程度的影响。当辐射剂量达1 500 Gy时，苜蓿叶片的上表皮厚度、下表皮厚度、叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和叶脉凸起厚度均达到最大值。

经不同辐射剂量处理后，苜蓿叶片的上表皮厚度、下表皮厚度、叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和叶脉凸起厚度均产生不同程度的变化(表3)。当辐射剂量为600和1 500 Gy时，其叶片厚度分别比对照组增加了6.43%和30.86%，上表皮厚度分别比对照组增加了3.95%和47.29%，下表皮厚度分别比对照组增加了4.39%和37.78%，叶脉凸起的厚度分别比对照组增加了4.09%和16.60%，栅栏组织厚度分别比对照组增加了8.06%和23.64%，海绵组织厚度分别比对照组增加了6.45%和26.96%。各辐射组与对照组间比较，在叶片的厚度、上下表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和叶脉凸起厚度均差异性显著(P<0.05)，辐射组之间比较，低剂量与高剂量辐射组间差异显著(P<0.05)，说明60Co-γ射线辐射对苜蓿叶片的结构产生了一定的影响，特别是高剂量辐射对叶片结构影响极大。

表2 60Co-γ处理下苜蓿种子的幼苗茎显微结构的特征Table 2 Stem structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

图2 60Co-γ射线辐射苜蓿种子的幼苗茎解剖结构Fig.2 Stems anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：1，2，3，4和5为辐射剂量为0，600，900，1 200和1 500 Gy时茎的显微结构(×40)， 6，7，8，9和10为辐射剂量为0，600，900，1 200和1 500 Gy时茎的显微结构(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of stems were in order of rsdiation dose of 0,600,900,1 200,1 500 Gy(×40),and the 6,7,8,9 and 10 micrographs of the stems were in order of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×400)

表3 不同剂量60Co-γ处理下苜蓿种子的幼苗叶片结构特征Table 3 Leaf structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

图3 60Co-γ射线辐射苜蓿种子的幼苗叶片解剖结构Fig.3 Leaves anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：1，2，3，4和5分别为对照和辐射剂量为0，600，900，1 200和1 500 Gy时叶片的显微结构(×40)， 6，7，8，9和10分别为对照和辐射剂量为0，600，900，1 200和1 500 Gy时叶片的显微结构(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of the leaves were in the ovder of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×40),and 6,7,8,9 and 10 microraphs of the leaves were in the order of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×400)

苜蓿叶片有明显的栅栏组织和海绵组织分化，其中叶片栅海比值、栅栏组织紧密程度和海绵组织的疏松程度见表4。不同辐射苜蓿叶片栅海比值均大于1，栅栏组织的厚度大于海绵组织的厚度。当辐射剂量为600，900，1 200，1 500 Gy时苜蓿叶片的栅海比、栅栏组织结构紧密度和海绵组织结构疏松程度均产生不同程度的影响。除辐射剂量为600 Gy时其栅海比与对照组比较增加时，其他辐射剂量的栅海比、栅栏组织结构紧密度和海绵组织结构疏松程度均有减小的变化趋势。辐射剂量为1 500 Gy时栅海比、栅栏组织紧实密度和海绵组织的疏松度分别比对照组减小了2.67%，25.00%和26.67%。60Co-γ射线辐射对苜蓿叶片的栅海比没有显著影响，但对栅栏组织的紧实密度、海绵组织的疏松度产生显著影响(P<0.05)，各辐射组之间无显著差异。辐射对叶片的上表皮厚度、叶片的厚度、下表皮厚度和栅栏组织厚度影响大，海绵组织的厚度、栅海比值、栅栏组织紧实密度和海绵组织疏松度影响比较大，叶脉凸起厚度影响最小。

表4 叶片显微结构参数测定结果Table 4 Determination results of leaf microstructure parameters

3 讨论与结论

根是植物吸收水分和营养物质最重要的器官，也是最先感受土壤逆境胁迫最重要的部位，茎是将根吸收的水、无机盐、以及叶制造的的有机物进行输导，在植物生长发育的过程中经常会遇到干旱、盐碱等不良环境条件的影响[8],植物会逐渐演化出各种各样形态结构以适应逆境。

本研究中根茎叶的显微结构对60Co-γ射线的辐射剂量变化的反应敏感，随着辐射剂量的增加，苜蓿根部的表皮厚度，皮层厚度维管柱直径、原生导管和后生导管的直径均有增加的趋势，这与植物对环境胁迫的响应有相似之处。如朱宇旌等[9]发现，在盐胁迫等逆境条件下，植物可以增加表皮、皮层薄壁细胞的厚度来抑制盐胁迫等渗透胁迫对植物根系的危害。本研究中，随着辐射剂量增加茎的表皮厚度、皮层薄壁厚度、维管束直径、髓直径也均有增加的变化趋势，刘海学等研究[10]NaCl胁迫对向日葵幼苗生长及茎组织解剖结构的影响，发现茎的解剖结构随着盐胁迫强度的增加而变化，薄壁细胞和皮层细胞层数明显增多，皮层厚角组织层数也均有增加，这与本研究的结果一致。此外，随着辐射剂量增加叶片厚度、上下表皮厚度、叶脉凸起厚度、海绵组织和栅栏组织厚度均有增加的趋势, 栅海比有减少的变化趋势，这与寇建村等[11]研究不同紫花苜蓿品种叶片的旱生结构和郭鹏等[12]对盐碱胁迫下紫花苜蓿的生理学及解剖学特征的研究结果基本一致。根茎叶的显微结构可随着环境的变化而变化，其结构特征最能体现环境因子与植物的协同进化。通过辐射使苜蓿根和茎的输导能力增加，叶片的光合效率增强，这可能是植物可抵御外界辐射影响的一个重要原因。

综上所述，60Co-γ射线辐射能够显著影响紫花苜蓿幼苗的根茎叶显微结构，不同剂量的60Co-γ射线辐射下苜蓿幼苗根、茎、叶显微结构差异显著，当辐射剂量为1 500 Gy时，与其它辐射剂量组别相比，所测各组织结构指数均达到最大值。而辐射剂量为1 800 Gy时，苜蓿干种子出苗后真叶未能长出，导致该辐射剂量下苜蓿无成苗，此辐射剂量可视为苜蓿种子60Co-γ射线辐射的致死剂量。