荒漠植物沙鞭(Psammochloa villosa)种质资源收集及谱系遗传分化初探

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(青海师范大学，青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海省自然地理与环境过程重点实验室，青藏高原环境与资源教育部重点实验室，青海 西宁 810008)

沙鞭(PsammochloavillosaBor.)是禾本科(Poaceae)、针茅族(Stipeae)、沙鞭属(Psammochloa)的一种多年生草本植物，主要分布于我国内蒙古高原及其毗邻沙区，如巴丹吉林沙漠、马兰布和沙漠、腾格里沙漠、库布齐沙漠、毛乌素沙地及甘肃河西走廊沙区、宁夏中北部和陕西北部沙区[1-2]，是这些极端沙地环境下分布的关键或唯一草本物种，不仅具有重要的生态价值，而且也是我国沙漠地区重要的优势牧草。沙鞭是单种属沙鞭属的一个模式种，最初系由Hitchcock[3]于1927年基于馆藏在美国自然历史博物馆的两份模式标本而发表的一个新物种，命名为PsammochloamongolicaHitchc.，这个物种得到我国诸多学者的普遍接受与认可[4-5]。此后，诸多学者对沙鞭的系统位置和物种名称进行了多次归隶和修订，尤其是1951年Bor[6]将沙鞭种名重新修订为PsammochloavillosaBor.，并详细阐述了其外部形态特征、生境及地理分布，是沙鞭分类学上的一个里程碑，特别是这些新的描述和修订至今仍被国内外绝大多数学者普遍采用[1-2,7-8]。沙鞭具长而横走的根状茎，圆锥花序紧密直立，小穗具有短柄、淡黄色或白色，外稃密被长柔毛等特征，主要通过克隆繁殖进行后代繁育，具有很强的建群能力，是我国内蒙古沙地及其毗邻地区的先锋植物和建群草本物种；对流动沙丘具有很强的适应性，是沙地植物群聚的优势种，是典型的旱生和沙生植物，对维持这一区域内的生态系统平衡具有不可低估的作用[2,7]。此外，沙鞭具有较强的耐旱、耐寒、耐碱以及抗病和抗风沙能力，加之花序相对粗长、穗多粒大等优点，是农牧业上禾草良种繁育和牧草利用的重要基因资源。

目前，国内外学者已从形态学、生理学、生态学等方面对沙鞭进行了研究报道。在形态学方面，董鸣[9]通过切断根茎对根茎禾草沙鞭和赖草克隆生长影响的比较研究，发现断茎处理对沙鞭基株的根茎、地上枝、主根茎等相关性状特征增量显著降低，但对沙生植物赖草却几乎无影响，表明沙鞭的克隆整合和生长特性赋予其在极端恶劣沙生环境中的生存能力；在生理学方面，黄振英等[10]通过对沙鞭种子在沙丘上萌发策略及幼苗耐干燥特性的研究表明，随着沙埋深度的增加，其种子萌发率和幼苗出土率下降；在生态学方面，徐翥骅等[11]通过对沙鞭和羊柴不同根围的土层土壤样品进行AM真菌空间分布及其与土壤因子的相关性研究，发现AM真菌能与沙鞭和羊柴形成良好共生关系；但关于荒漠植物沙鞭遗传多样性的研究起步较晚且报道甚少，仅见王可青等[12]采用等位酶电泳技术，对毛乌素沙地沙鞭种群进行了遗传多样性研究，发现沙鞭遗传变异水平低于同类植物，并且绝大多数遗传变异存在于种群间；此后，Li[13]利用ISSR分子标记技术，对来源于我国西北地区7个沙鞭种群的遗传变异和克隆多样性进行了研究，发现沙鞭天然种群的遗传变异水平较高，种群间遗传分化远大于种群内，同时还发现利用ISSR分子标记技术获得的沙鞭遗传多样性参数值比利用等位酶电泳技术得到的数值准确、可靠。上述研究不仅对系统评价沙鞭的抗旱性，筛选抗旱性强、表现好的种质资源提供了重要理论依据，而且能够促进牧草品种改良和抗逆性筛选，并为揭示克隆植物与沙生环境关系及其潜在进化意义提供基础资料。据此，本文研究集中在内蒙古高原及其毗邻地区调查沙鞭的具体自然地理分布、种质资源收集结果以及初步利用nrITS序列进行的遗传分化研究，旨在为沙鞭未来的研究和资源利用提供科学合理的资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料全部来源于野外采集的新鲜幼嫩、无病虫害，用硅胶干燥的沙鞭叶片，从采集材料中选取具有代表性的60个沙鞭种群，再从每个种群材料中选择3个具有标准形态和代表性的个体作为研究材料，进行nrITS序列的扩增和测序。此外，本研究选择丝颖针茅(Stipacapillacea)作为外类群。

1.2 试验方法

1.2.1野外调查和群体采样 在广泛查阅现有沙鞭文献资料，中国科学院西北高原生物研究所青藏高原生物标本馆(HNWP)、中国科学院植物研究所标本馆(PE)等馆藏标本，以及中国数字植物标本，地方植物志和各类野外调查研究结果对荒漠植物沙鞭天然分布产地记录基础上，详细标记其产地，发现荒漠植物沙鞭主要分布于我国内蒙古高原的几个沙地，因此将上述所有标本采集地视为重点采集区域，并对所有地点进行群体采样，同时对其毗邻地区是否有该物种分布也进行较为全面的野外调查和群体采样；具体调查范围为37°25'29.1''～43°7'11.8'' N，104°40'5.0''～112°54'23.5'' E，海拔976～1 707 m。发现沙鞭典型种群进行GPS定位，同时详细记录每个种群的生态因子信息(如年平均温度、年降水量、经纬度、海拔高度等)，并注意观察其生长环境(如温度、坡度、坡向及土壤等)。

1.2.2nrITS提取、扩增和数据分析 本研究采用改进的CTAB法[14]，从硅胶干燥的沙鞭植物叶片中提取全基因组DNA；然后，选用引物ITS1和ITS4进行nrITS序列的扩增和测序，引物序列为ITS1：5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；PCR扩增的反应体系和反应条件参考刘玉萍[15]、王倩[16]等学者的相关研究内容。扩增反应是在ABI公司生产的ABI 9700 PCR仪上进行，利用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测(图 1)，PCR产物由北京华大基因测序有限公司进行常规测序。所有序列用软件Clustal X 1.81[17]和进行比对并加以手工校对；DnaSP 5.0软件[18]统计每个片段的插入缺失和单核苷酸多态性；采用启发式搜索和MrBayes 3.1[19]进行系统发育树的构建和分析，并检验它们之间的遗传差异，给出重复1 000次各分支的自展支持率BV(bootstrap value)值和贝叶斯系统树(bayesian inference，BI)后验概率PP值。

图1 PCR产物凝胶电泳图Fig.1 The gel electrophoresis of nrITS PCR product注：DNA marker为2000bp。从上到下由2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp共6条双链DNA片段组成Note：DNA marker is 2000bp. From top to bottom, there are 6 double-stranded DNA fragments of 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp and 100bp

2 结果与分析

通过我们2013-2016年的详细调查，目前已经收集到中国甘肃、宁夏、陕西以及内蒙古等绝大多数野外自然地理分布区的沙鞭种群种质资源材料，共有60个种群(图2)，每个种群收集到5～10株，间隔200 m以上，其中包括450个的个体DNA材料、以及45个种群的成熟种子，每个种群采集不少于5个的个体材料为凭证标本。此外，我们对沙鞭60个种群的采集地、经纬度、海拔和生境等也作了详细记录(表1)。上述所有凭证标本、DNA种群样品和成熟种子等均暂且保存于青海师范大学青藏高原植物标本室(QHNUBI)。

图2 沙鞭种质资源采集地理分布图Fig.2 Sampling locations of Psammochloa villosa in the Inner Mongolian Plateau

表1 沙鞭种质资源采集信息表Table 1 Sampling information of Psammochloa villosa

续表1

续表1

注：NX，宁夏；NMG，内蒙古；SX，陕西

Note: NX, Ningxia; NMG, Neimenggu; SX, Shanxi

基于nrITS序列构建的系统发育树结果表明，两种方法构建的系统发育树拓扑结构极为相同，只是支持率略有不同(图3)；同时，我们还发现所有参试种群核糖体核基因序列存在显著差异，将它们分成两个较为明显的谱系遗传分支，即一个分支(A)主要由生长于内蒙古高原东部的所测个体构成，并在两种方法中得到100%的BV值和100%的PP值；另一分支(B)主要由采自内蒙古高原西部的所测个体组成，在两种方法中也得到较高支持率100%的BV值和100%的PP值。

3 讨论

核基因组核糖体DNA内转录间隔区(nuclear ribosomal internal transcribed spacer，nrITS)已经成为被子植物特别是较低分类阶元分子系统学、谱系地理学和生物多样性研究中应用最为广泛的一个核核糖体片段，尤其是它现已发展成为种子植物DNA条形码的核心条形码[20]。通常nrITS片段不仅长度稳定和通用性好[21]，而且变异速率较高，能够提供较丰富的遗传变异信息位点[22]，因而它已被国内外诸多学者普遍用来从分子水平上探讨植物的谱系遗传分化研究，并取得一系列研究成效[23-25]。沙鞭作为一种重要的防风固沙植物种质资源，它已经引起广泛关注，并对其开展了种子萌发特性、克隆生长特点、遗传多样性等方面的诸多研究，本研究团队也已对其主要自然地理分布区的种质资源进行了3年的野外调查和群体采样。据此，利用nrITS序列对沙鞭已有种群材料进行了相关研究。结果发现沙鞭的所有参试类群构成一个单系，nrITS序列间存在显著差异，能将它们分成较为明显的谱系遗传分支， 表明该物种种群间遗传分化显著，这可能与其对不同荒漠条件具有较强适应能力有关。在野外调查和群体采样中也发现，内蒙古高原东西部的沙鞭种群在植株高度、叶片被毛状况、圆锥花序和小穗长度、外稃被毛等许多外部形态特征上存在着较大差异。荒漠植物沙鞭的遗传分化、种群动态及分布式样等科学问题需要以后完成全面野外调查和群体采样，并在种群水平上对多种遗传背景分子数据综合分析和模拟后，才能阐明全球气候变化尤其是第四纪冰期是如何深刻影响我国西北干旱荒漠区荒漠植物沙鞭种群遗传结构、遗传分化及种群动态历史的原因。

因此，能够开展和需要完成研究工作主要包括：⑴通过群体水平上广义形态性状的统计分析，阐明沙鞭种群内和种群间遗传多样性及其空间分布格局，寻找引起沙鞭变异的主要表型性状，探讨沙鞭表型性状变异、以及其与地理和生态因子之间的相关性。⑵模拟干旱梯度胁迫，对沙鞭种子萌发期和幼苗期进行抗旱性研究，筛选抗逆性强的优良种质资源种群。⑶利用不同类型的分子标记，从群体水平上比较和评价沙鞭的遗传多样性，探讨其遗传多样性特点和遗传结构模式。⑷采用多种不同遗传背景分子标记的联合分析，并利用生态位(ENM)模拟相结合的方法，系统探讨沙鞭种群遗传变异的地理分布式样，结合现代植物分子群体遗传学分析方法，全面追述其现代分布种群的进化历史、分布格局形成的历史原因、温度下降时的避难所以及回升后的扩散/回迁路线。并且还可利用已采集的沙鞭种质资源材料，采用比较基因组学等分子生物学和遗传学方法，研究和提取沙鞭的优良抗逆基因，然后通过转基因技术将其转入到其它禾本科牧草(如披碱草、针茅)和农作物 (如小麦、玉米、青稞)中，筛选培育适合不同用途且抗逆性强的新品种。总之，通过长时间全面系统的野外考察和群体采样，目前本研究团队已经收集到较为完整的沙鞭种质资源，不仅为其不同基因型多个种群种质资源的收集和整理提供了材料基础，而且也为今后研究和利用这些种质资源提供了保证。

图3 基于nrITS序列数据构建的最大简约树和Bayesian 50%多数规则一致性树，分支上数字分别代表最简约树(MP)的自展支持率和Bayesian后验概率Fig.3 The most parsimonious tree based on nrITS sequences and 50% of Bayesian majority rule consensus tree based on nrITS sequences. Numbers above the branches indicate bootstrap support and the Bayesian posterior probabilities respectively

4 结论

本研究通过对沙鞭广泛的野外考察，共采集沙鞭60个种群的凭证标本、450个的个体DNA材料及45个种群的成熟种子；同时，本文还利用DNA分子标记对沙鞭谱系分化进行了初步探讨，发现沙鞭种群存在明显的遗传分化，可能与内蒙古高原特殊的地理气候条件有关。因此，这种系统种群水平上沙鞭种质资源的材料收集，对今后探讨沙鞭的遗传多样性及其分布格局、适应进化和分布扩散、抗旱适应性生理生态机制、以及响应第四纪气候变迁的生物地理学模式提供重要基础。