紫花苜蓿叶总黄酮提取及抗氧化性

许英一， ，

(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006； 2. 黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006； 3. 黑龙江省畜牧研究所， 黑龙江 齐齐哈尔161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)为多年生豆科牧草，是重要的饲料作物。分布广泛，产草量高，营养丰富，适口性好，适应性强，被称为“牧草之王”[1]。紫花苜蓿中含有植物叶蛋白、皂苷、黄酮类、类胡萝卜素、酚醛酸等多种生物活性成分，因此，苜蓿在抗衰老、抗菌、抗病毒、抗癌、抗肿瘤、护肝、抑制高血压、高血脂、调节内分泌系统、增强机体免疫力、预防心血管疾病及止痛镇痛等方面都具有良好的作用[2-3]。同时黄酮类化合物也是重要的功能食品添加剂、饲料添加剂[4]、天然抗氧化剂, 具有保鲜和护肤美容作用[5]。

目前，人们对大豆、辣木(MoringaoleiferaL.) 等植物中黄酮类化合物的提取及抗氧化性进行了大量研究，而对紫花苜蓿提取及抗氧化性研究很少。岳爱琴等[6]采用有机溶剂法提取大豆中异黄酮，得率为9.18%；岳秀洁等[7]采用超声提取辣木叶黄酮，得率为(48.93±0.44)mg·g-1；张咏梅等[8]采用微波辅助提取苜蓿黄酮，黄酮得率仅为4.92mg·g-1，限制了苜蓿黄酮在食品生产中的应用和其抗氧化性等功能特性的研究。提取黄酮的方法有溶剂浸提法、微波提取法、超临界 CO2萃取法、纤维素酶法、超声波提取法等[9]。近年来，超声波提取技术被广泛用来萃取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等[10-11]。该技术具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。本研究旨在采用对超声波辅助提取苜蓿叶黄酮工艺条件进行优化，并对提取的总黄酮进行抗氧化性能的研究。为进一步研究和开发利用紫花苜蓿黄酮类化合物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

紫花苜蓿，黑龙江省畜牧研究所提供。DPPH，美国sigma公司；芦丁标准品，中国药品生物制品检定所；其它试剂均为国产分析纯。

722N 可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；BS224S 电子天平， 北京赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-300DE 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；WK-600高速药物粉碎机，青州市精诚机械有限公司；日立CR21G高速冷冻离心机，天美(中国)科学仪器有限公司；HHS21-4 电热恒温水浴锅，上海跃进医疗器械厂。

1.2 试验方法

1.2.1提取方法

(1)乙醇浸提法 准确称取 5.0 g 经过处理的紫花苜蓿叶粉末置于 500 mL 锥形瓶中，加入 80% 的乙醇 100 mL 回流浸提3 h，收集浸提液，滤渣重复浸提1次，合并2次的浸提液，测定总黄酮得率。

(2)超声波辅助水提取法 准确称取 5.0 g 经过处理的紫花苜蓿叶粉末置于 250 mL 锥形瓶中，加入 100 mL 蒸馏水，在温度为60℃、超声功率为180 w的条件下超声提取 30 min，收集浸提液，滤渣重复浸提1次，合并2次的浸提液，测定总黄酮得率。

(3)超声波辅助乙醇提取法 准确称取 5.0 g 经过处理的紫花苜蓿叶粉末置于 250 mL 锥形瓶中，加入100 mL 80% 的乙醇，在温度为60℃、超声功率为180 w的条件下超声提取30 min，收集浸提液，滤渣重复浸提1次，合并2次的浸提液，测定总黄酮得率。

1.2.2超声波辅助乙醇提取紫花苜蓿叶总黄酮的工艺优化

(1)单因素试验

准确称取5.0 g 经过处理的紫花苜蓿叶粉末，固定料液比1:20(g·mL-1)，以乙醇体积分数80%，提取温度50℃，提取时间30 min，超声功率180 w为单因素试验的基础条件。但研究某一因素时，其他条件保持不变。乙醇体积分数分别为 60%，70%，80%，90%，100%，提取温度分别为20，30，40，50，60 ℃，提取时间分别为10，20，30，40，50 min，超声功率分别为120，150，180，210，240 w，按上述设计做单因素试验。所得浸提液按标准曲线处理方法测定吸光度，计算总黄酮得率，每组3次重复。

(2)正交试验

在单因素试验基础上，采用 L16(45)正交试验对紫花苜蓿叶总黄酮的提取条件进行优化，设定正交试验因素水平，见表1。

1.2.3苜蓿叶总黄酮类化合物的测定

(1)标准曲线绘制

按照白吉庆等[12]文献中的方法，以芦丁为标准品，采用 NaNO2/Al( NO3)3显色法，绘制标准曲线。以吸光值为纵坐标，芦丁质量浓度(C，mg·mL-1)为横坐标绘制芦丁标准曲线，得线性回归方程为y=11.025x+0.011，R2=0.9990，表明在0.02～0.1 mg·mL-1范围内溶液吸光度和芦丁对照品的质量浓度呈良好的线性关系。

(2)苜蓿叶总黄酮含量测定

吸取一定体积苜蓿叶黄酮提取液，按照绘制标准曲线同样方法测定苜蓿叶黄酮的吸光度。根据标准曲线回归方程计算得到总黄酮质量浓度(C)，按公式(1)计算样品中总黄酮得率(P)。

(1)

式(1)中，C—由标准曲线计算得出的质量浓度(mg·mL-1)；N—提取液稀释倍数；V—苜蓿总黄酮原液的总体积(mL)；m—苜蓿原料质量(g)。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4抗氧化活性测定

(1) DPPH自由基清除率的测定

参照Shimada[13]的方法略做调整。分别取稀释后不同浓度样液2 mL于试管内，加入0.04 g·L-1的DPPH自由基无水乙醇溶液2 mL，混合均匀，避光30 min，在517 nm处测得的吸光值记为Ai。另取样液2 mL放于试管中，加入2 mL无水乙醇，避光反应20 min，在517 nm下测定的吸光值记为Aj。用0.04 g·L-1的无水乙醇溶液2 mL与无水乙醇2 mL反应作为参比，吸光值记为A0。同时以VC做阳性对照，计算公式为：

(2)

(2) 还原力的测定

参照Oyaizu[14]的方法略做改动。取2.0 mL稀释后不同浓度样液于试管中，分别加入0.2 mol·L-1pH6.6的磷酸盐缓冲液2.0 mL，质量分数1%的铁氰化钾[K3Fe(CN)6]溶液2.0 mL，混匀，在50 ℃水浴下保温20 min，再加入质量分数10%的三氯乙酸(TCA)溶液2.0 mL，震荡摇匀后以4 000 r·min-1离心10 min。取离心后上清液2.5 mL，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL质量分数为0.1% 的FeCl3溶液，震荡摇匀后在50℃水浴下保温10 min，在700 nm下进行比色，以去离子水作为空白，同时以VC做阳性对照。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0软件对所测数据进行统计分析，所有试验均重复3次，各实验数据均以平均值和标准误差表示测定结果，对正交试验设计进行方差分析，并用Duncan 法对各测定数据进行多重比较，不同字母表示组间比较差异显著；采用Excel 制图。

2 结果与分析

2.1 提取方法比较

3种提取方法对黄酮提取效果的影响结果如图1 所示，3种提取方法中，超声波辅助乙醇法提取苜蓿叶总黄酮得率较高，且与另外2种方法总黄酮得率相比，均具有显著性差异(P<0.05)，因此选择超声波辅助乙醇法进行后续优化试验。

图1 提取方法的比较Fig.1 Comparison of extraction method注：不同字母表示差异显著(P<0.05)Note：Different letters indicate significant differences at the 0.05 level

2.2 单因素试验结果

各因素对对总黄酮得率的影响如图2所示，4个因素对总黄酮得率的影响均具有显著性差异(P<0.05)。单因素试验结果表明：最佳乙醇体积分数为80%；最佳提取温度为50℃；最佳提取时间为30 min；最佳超声功率为180 w。

图2 4个因素对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of four different factors on total flavonoid yield注：不同字母表示差异显著(P<0.05)Note: Different letters indicate significant differences at the 0.05 level

2.3 正交试验结果、方差分析及多重比较

由表2 可知，通过极值 R 大小得出各因素对苜蓿叶总黄酮得率影响的顺序为：提取温度>超声功率>乙醇体积分数>提取时间。 由表 3 方差分析得出：提取温度、超声功率、乙醇体积分数对总黄酮得率的影响差异极显著(P<0.01)，乙醇体积分数的影响显著(P< 0.05)。由表 4 多重比较分析得出：苜蓿叶总黄酮最佳工艺参数为A1B4C2D3。

表2 正交设计结果Table 2 The results of orthogonal design

表3 正交设计方差分析表Table 3 The variance analysis form of orthogonal design

注：*表示显著(P<0.05)；**表示极显著(P<0.01)

Note: * indicates significant at the 0.05 level；**indicates extremely significant at the 0.01 level

表4 乙醇体积分数、提取温度、提取时间、超声功率4因素多重比较结果(SSR法)Table 4 The multiple comparison results of 4 factors on the ethanol volume fraction，extraction temperature，extractiontime and ultrasonic power(SSR Methods)

2.4 验证试验

准确称取一定量苜蓿粉末3份，按上述最佳工艺参数,即A1B4C2B3超声提取，测定吸光度，得到苜蓿总黄酮得率为6.43 mg·g-1，大于正交试验中16个工艺参数的结果，即A1B4C2D3为最佳工艺参数，此时苜蓿总黄酮得率为6.43 mg·g-1。

2.5 总黄酮抗氧化活性分析

2.5.1苜蓿总黄酮对DPPH 自由基清除作用 苜蓿黄酮及抗坏血酸对DPPH自由基清除率结果如图6、图7所示。从图6可以看出，在苜蓿总黄酮的剂量为0.2 ～1.0 mg·mL-1范围内呈一定的剂量效应，随着苜蓿黄酮的浓度的增大，对DPPH自由基清除率呈现增大趋势。通过对数据统计分析可以得出黄酮质量浓度与清除率的回归方程为y=71.57x+17.51 (R2=0.9863)，其半抑制浓度(IC50值)为0.608 mg·mL-1；阳性对照Vc的浓度增大，其抑制率也增大，Vc的质量浓度与清除率的回归方程为y=8.0745x+19.139 (R2= 0.9717)，Vc在浓度很低时就体现出了抑制性，其半抑制浓度(IC50值为4.952 μg·mL-1)，由此可看出在同等质量的条件下苜蓿总黄酮的抑制率低于Vc的抑制率。DPPH自由基清除率苜蓿叶总黄酮相当于Vc的量即Vc当量为8.145 μg·mg-1。

图6 苜蓿叶总黄酮对DPPH自由基清除率Fig.6 DPPH radical scavenging capacity oftotal flavonoids from alfalfa leaf

图7 Vc对DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH radical scavenging capacity of Vc

2.5.2苜蓿总黄酮的还原力 苜蓿总黄酮及抗坏血酸的还原力测定结果如图8、图9所示。苜蓿叶总黄酮和Vc的还原能力随着质量浓度的增大而增强，且呈明显的量效关系。虽然其还原力低于Vc，但还是表现出了较强的还原力。

图8 苜蓿叶总黄酮的还原力Fig.8 Reducing power of total flavonoidsfrom alfalfa leaf

图9 Vc的还原力Fig.9 Reducing power of Vc

3 讨论与结论

3.1 提取方法的选择

黄酮类化合物的制备方法主要有水提取法、有机溶剂提取法、二氧化碳超临界流体萃取法、超声波辅助提取法等。水提法提取率较低，提取液易腐败变质，且后续的过滤、干燥除去溶剂等操作困难；有机溶剂提取法克服了水提法产物存放易霉变等缺点，提取率高，这与蛋白质等杂质在乙醇中难溶或微溶有关。后续的干燥、过滤等操作也比较容易进行；超声波辅助提取技术，因具有提取时间短、提取效率高、节约成本等优点[15]，已经广泛应用于很多植物黄酮的提取。最常见的黄酮类化合物的提取方法是有机溶剂提取法，目前也有一些文献采用超声波辅助乙醇提取法，但采用超声波辅助水提取法提取黄酮类化合物的还未见报道。本试验比较了乙醇浸提法、超声波辅助水提取法和超声波辅助乙醇提取法3种方法的总黄酮得率，分别为(4.23±0.08)mg·g-1、(4.59±0.08)mg·g-1和(5.44±0.12)mg·g-1，超声波辅助乙醇提取法的总黄酮得率最高，且与另2种方法总黄酮得率相比，均具有显著差异。因此采用超声波辅助乙醇提取法。优化试验结果表明超声波辅助乙醇提取苜蓿叶总黄酮的最佳工艺为：乙醇体积分数 70%、提取温度 60 ℃、提取时间 30 min、超声功率180 w，苜蓿叶总黄酮得率为6.43 mg·g-1，得率显著高于赵娅敏等[16]超声辅助提取甘肃紫花苜蓿黄酮得率(1.7643 mg·g-1)，同时也高于刘香萍等[17]超声辅助提取紫花苜蓿叶黄酮得率(5.29 mg·g-1)。关于苜蓿叶总黄酮的研究及其分离纯化目前已经取得初步进展，本研究仅对苜蓿叶总黄酮提取方法的优化进行了初步的探讨，为后续苜蓿叶总黄酮的分离纯化提供技术支撑，而苜蓿叶总黄酮的主要成分的分离以及药用价值有待于做进一步验证。

3.2 苜蓿叶总黄酮抗氧化活性

黄酮类化合物除作为药品用于临床[18]，还可作为食品、化妆品等的天然添加剂，已有研究以黄酮为功能指标，研制和开发了山楂叶黄酮的保健类产品，具有很好的发展前景。DPPH·是一种稳定的自由基，在可见光区有特征吸收，比色测定简便、快捷。当自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使乙醇溶液颜色变浅，最大吸收波长处的吸光度变小，且颜色变浅的程度与配对电子数呈剂量关系，因此可用于物质清除自由基的研究与天然抗氧化剂的筛选[19]。超声波辅助提取的苜蓿叶总黄酮对DPPH·清除率可达85.76%，这与朱宇旌等[20]研究表明的苜蓿黄酮具有较强的抗氧化性的结果相一致；苜蓿叶总黄酮清除DPPH·的 Vc当量为8.145 μg·mg-1。还原力是评价物质抗氧化活性的重要指标，该方法的机理是抗氧化剂将Fe3+还原成Fe2+的形式，从而中断自由基的链式反应。还原能力的大小可以通过在波长700 nm处的吸光度来检测，吸光度越大还原力越大，抗氧化能力越强[21]。当苜蓿叶总黄酮的浓度为1 mg·mL-1时，其还原力达0.82，但不及VC。苜蓿叶总黄酮抗氧化能力随着质量浓度的升高逐渐增强，但不及VC,这一点与胡卫成[22]研究表明的莲蓬壳具有较强的抗氧化性的结果相一致。说明超声提取的苜蓿叶总黄酮具有较好的抗氧化活性，可用作天然的抗氧化剂原料。该研究也为苜蓿叶总黄酮资源的进一步综合利用提供了重要依据。