自发矮小症雌性SD 大鼠不孕的机制初探

龙红,霍春茂,李康,包峰云,秦廷洋,赵玉佳,张仕斌

(贵州遵义医科大学实验动物中心,贵州遵义 563000)

本课题组偶然发现在封闭群SD 大鼠的繁育过程中出现具有自发矮小特征的大鼠,在前期的表型特征及遗传模式鉴定过程中发现矮小雌性大鼠不孕[1]。 不孕不育已成为一个全球性的生殖健康问题,全世界约有15%的夫妻受到影响[2],而结婚年龄、妇科手术史、甜食和卵巢储备减少等都是造成不孕的因素[3]。 笔者推测SSR 雌性不孕可能与卵巢储备功能下降及卵巢低反应有关系。 本研究通过探索SSR 雌性大鼠不孕的机制,期望为人类不孕不育的研究和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

7 只SPF 级雌性SSR 大鼠和3 只SPF 级野生型雌性SD 大鼠,体重分别为188 ~ 220 g 和240 ~245 g,均为9 周龄,由遵义医科大学实验动物中心提供【SCXK(黔)-2021-0002】,饲养于遵义医科大学实验动物中心屏障系统实验室【SYXK(黔)-2021-0004】。 大鼠在饲养期间均自由采食和饮水,湿度控制在40% ~ 60%,温度控制在20 ~ 26℃,昼夜各半明暗交替。 本动物实验经过遵义医科大学实验动物福利伦理委员会审批(ZMU21-2203-575)。

1.1.2 主要试剂与仪器

革兰氏染色液(快速法)(贝索生物技术有限公司); 人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, hCG) 和孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG)(宁波第二激素厂);大鼠雌二醇(E2)ELISA 试剂盒、大鼠促卵泡素(FSH)ELISA 试剂盒、大鼠黄体生成素(LH)ELISA 试剂盒、大鼠缪勒管抑制物质(AMH)ELISA试剂盒、大鼠孕酮(PROG)ELISA 试剂盒(上海纪宁实业有限公司)。 普通光学显微镜(SDPTOP US510CA)、体视镜(OLYMPUS SZ61)、倒置显微镜(SDPTOP HAL)。

1.2 方法

1.2.1 动情周期的观察

将野生型SD 大鼠作为对照组(WT),SSR 雌性不孕大鼠作为实验组(Mut),进行动情周期的观察。将每只大鼠进行编号标记,采用阴道拭子法[4],每天9:00 采样制作阴道涂片,直至出现2 个完整动情周期。 阴道涂片及快速染色方法[5]:用生理盐水将消毒棉签浸湿,插入大鼠阴道口1 ~ 2 cm,轻轻旋转3 圈,快速均匀地涂在载玻片上,待自然风干。 滴加1 ~ 2 滴龙胆紫溶液染色10 s,水洗后甩干;滴加适量碘溶液染色10 s,水洗后甩干;加2 滴脱色液20 s, 水洗后甩干;最后加1 ~ 2 滴沙黄溶液复染10 s, 水冲洗,自然风干,镜检。

1.2.2 血清AMH、E2、FSH、LH 和PROG 水平检测

将大鼠麻醉后,颈静脉采血1 mL,放置30 min,离心机设置3000 r/min,时间10 min,得到大鼠血清。 随后利用酶联免疫吸附试验法检测血清中AMH、E2、FSH、LH 和PROG 五项指标水平。

1.2.3 促排卵观察

10 只大鼠腹腔注射PMSG 15 IU/100 g,48 h 后腹腔注射hCG 7.5 IU/100 g,注射24 h 后,麻醉大鼠,处死。 打开腹腔,剪断输卵管,移至倒置显微镜下定位输卵管膨大部位置,快速用针头划破膨大部,卵母细胞成团自动涌出。 用透明质酸酶处理卵母细胞团,除掉包裹在外的卵丘颗粒细胞,镜下计数。

1.2.4 转录组学分析

取野生型SD 雌性大鼠和SSR 雌性不孕大鼠各3 只,分别编号为WT01、WT02、WT03 和Mut01、Mut02、Mut03。 将其卵巢组织送中科新生命公司进行转录组学测序。 用DESeq2 进行基因的差异表达分析,将padj < 0.05,｜log2foldchange ｜> 2 作为差异显著性标准筛选差异表达基因。 STRING 设置连接度> 0.4 绘制蛋白互作网络图(protein-protein interaction network, PPI); MCODE 插件中设置Degree cut-off = 2、Node Score cut-off = 0.2 及K-Core = 2 获取模块。

1.3 统计学分析

采用基迪奥生信云平台对相关数据进行统计学分析。 计量资料以平均值± 标准差(±s)表示,多样本计量资料选择T检验分析,P< 0. 05 则表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动情周期的比较

10 只雌性大鼠阴道涂片未见异常,动情周期均为4 ~ 5 d。 10 只雌性大鼠阴道涂片观察完整动情周期变化如图1。 实验组体重显著低于对照组,卵巢指数和子宫指数显著高于对照组,卵巢和子宫则无显著变化(图2)。

图1 动情周期比较Figure 1 Comparison of estrous cycle

图2 两组之间体重、卵巢、子宫、卵巢指数及子宫指数的变化Note. Compared with WT, *P < 0.05, **P < 0.01. (The same in the following figures)Figure 2 Changes in body weight, ovaries, uterus, ovarian index and uterine index between the two groups

2.2 超排效果比较

在PMSG 15 IU/100 g + hCG 7.5 IU/100 g 剂量组合下,性成熟大鼠可以获得最佳排卵效果[6-7]。排卵结果显示,对照组平均排卵数量38 个,显著高于实验组(平均排卵数量3 个)。

2.3 10 只大鼠血清AMH、E2、FSH、LH 和PROG水平比较

对照组大鼠血清AMH(P< 0.01)、E2(P<0.05)水平显著高于实验组,对照组大鼠血清FSH(P< 0.01)、LH(P< 0.01)及FSH/LH(P< 0.05)水平显著低于实验组,对照组大鼠血清PROG 与实验组比较不显著,见图3。

图3 两组之间AMH、E2、FSH、LH、FSH/LH、PROG激素的比较Figure 3 Comparison of AMH, E2, FSH, LH, FSH/LH,PROG hormones between two groups

2.4 转录组数据分析

2.4.1 样品间相关性评估

样品间基因表达水平相关性是检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标。 样品之间表达模式的相似度越高,则相关性系数越接近1。 本次测序样本之间的相关性系数大于0.89(图4),符合重复样本的选择。

图4 样品间相关系数热图Figure 4 Heat map of correlation coefficients between samples

2.4.2 差异基因的筛选

用DESeq2 进行基因的差异表达分析,将padj <0.05,｜log2foldchange ｜> 2 作为差异显著性标准。 差异基因分析显示,与正常组相比,不孕组共有250 个差异表达基因,其中有190 个上调基因,60个下调基因(图5)。

图5 差异基因表达分布火山图Figure 5 Volcano map of differential gene expression distribution

2.4.3 差异基因的分析

对获得的250 个差异表达基因进行GO 功能和KEGG 通路富集分析。 挑选GO 三大分类中最显著的20 个功能条目作图(图6),在生物学过程分类中,差异表达基因主要富集在磷酸化的正向调节(positive regulation of phosphorylation)、磷脂酶活性的调节(regulation of phospholipase activity)、磷代谢过程的正调控(positive regulationof phosphorus metabolic process)等;在细胞组成分类中,主要富集在细胞外区(extracellular region)、细胞外间隙(extracellular space)等;在分子生物学分类中,主要富集在白细胞介素-1 受体结合(interleukin-1 receptor binding )、 细胞因子活性 ( cytokine activity)等。

图6 差异基因KEGG 富集柱状图(TOP 20)Figure 6 KEGG enrichment histogram of differential genes (TOP 20)

挑选KEGG 富集中最显著的20 条pathway 条目作图分析,发现这些差异表达基因主要富集在IL-17 信号通路(IL-17 signaling pathway)、p53 信号通路(p53 signaling pathway)和细胞因子-细胞因子受体 相 互 作 用 ( cytokine-cytokine receptor interaction)等。

2.4.4 蛋白互作网络分析及Hub 基因筛选

为更好地理解这些差异基因间的相互关系,应用TRING 蛋白互作数据库绘制PPI 图(图7)。

图7 差异基因的蛋白互作图Figure 7 Protein-protein interaction (PPI) network

使用Cytoscape 软件中的MCODE 插件创建分子模块,设置分数大于4,获得2 个功能模块。 在图8 中,基因Cxcl1、Cxcl2、IL1a、IL1b、Cd80、Mmp13、Mmp8、 Fgf3、 Ptgs2 聚集在模块1 中。 再使用CytoHubba 插件的MCC、MNC、EPC 和Degree4 种拓扑计算法分别筛选前10 的重要节点,作VEEN 图取交集(图9),最后获得9 个Hub 基因,分别为Cxcl1、Cxcl2、IL1a、IL1b、Cd80、Mmp13、Mmp8、Fgf3、Ptgs2

图8 2 个MCODE 测定分数> 4 的关键模块Figure 8 Two key modules with score > 4 were detected by MCODE

图9 MCC、MNC、EPC 和Degree 插件的Hub基因VENN 图Figure 9 VENN diagram screening Hub gene with MCC,MNC, EPC and Degree

基因。 模块1 中的基因与筛选的9 个Hub 基因完全重叠,推测该模块的9 个基因是SSR 雌性大鼠不孕的关键基因。

3 讨论

本课题在研究过程中发现,SSR 大鼠部分雌性大鼠不孕,为探究其不孕机理展开了研究。 动情周期检测结果显示,不孕大鼠和正常大鼠的动情周期未见异常,但超排后,不孕大鼠的排卵数显著低于正常组。 因此,本研究结果提示SSR 雌性不孕大鼠的卵巢储备功能发生障碍。

目前,临床上将AMH、FSH、LH、E2 作为卵巢功能评估的常用指标。 AMH 是临床上评估卵巢储备功能和卵巢反应性的首选生物标志物,其值大小与卵母细胞数量呈正相关[8-9]。 本研究中SSR 雌性不孕大鼠血清AMH 水平显著低于正常组,对应排卵数也显著低于正常组。 有研究结果表明,与空白对照组相比,卵巢储备功能减退大鼠的血清AMH 和E2 水平显著降低,FSH 和LH 水平显著增加[6-10],与本研究结果相符。 有研究表明FSH/LH 能够预测卵巢的反应性,并评估不孕患者卵巢储备功能[11]。王紫微等[12]研究表明,随着FSH/LH 的升高,卵巢低反应的发生率也随之增加。 周洪梅等[13]的研究发现,FSH/LH 在卵巢高反应、卵巢正常反应和卵巢低反应中呈逐渐升高的趋势。

为探究SSR 雌性不孕大鼠的病理机制,本课题组采用转录组测序方法来分析其不孕机理。 结果显示,与对照组相比,不孕组获得250 个差异表达基因,其中有190 个上调基因,60 个下调基因。 将差异基因作富集分析,发现这些差异表达基因主要富集在IL-17 信号通路、p53 信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等。 有研究报道,在美洲长春花小肽(small peptides from periplaneta americana,SPPA)改善过氧化氢诱导的人类颗粒细胞凋亡的机制研究中发现,S100A7、S100A9、RELA 和IL17RE参与IL-17 信号通路,在抵抗细胞凋亡过程中发挥了重要作用[14]。

本研究筛选的Hub 基因中,IL1a、IL1b 主要由受刺激的单核细胞产生,是炎症过程的关键诱导因子,被推测在慢性炎症疾病中发挥作用[15]。 衰老的Nlrp3-/-小鼠和同龄的野生型小鼠相比,卵巢中主要的促炎症基因IL1a、IL1b 表达水平降低,巨噬细胞浸润减少,卵泡储备量增加[16]。 本研究中,IL1a、IL1b 表达上调,可能导致卵泡储备减少。

Cxcl1 和Cxcl2 属于CXC 类趋化因子家族中的成员之一,能与单核细胞、中性粒细胞和T 细胞等表面受体结合,参加细胞毒效应。 子宫内膜中的Cxcl1 可使B 淋巴细胞选择性外渗到子宫内膜间质,从而引起子宫内膜和输卵管的炎症[17]。 李兆萍等[18]在输卵管阻塞性不孕的临床治疗研究中发现,经治疗后,不孕患者的血清Cxcl1 水平降低了。

Mmp8 和Mmp13 基因是编码单核细胞来源的基质金属蛋白酶(MMPs)的基因,MMPs 参与卵泡发生、卵泡闭锁和细胞外基质(ECM)的重塑过程[19],是人类排卵的关键因素[20]。 研究报道,MMP、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)和转化生长因子-β1(TGF-β1)等相互协调作用紊乱会破坏ECM 的合成与降解的稳态,形成卵巢纤维化[21],导致不孕。 本研究中,SSR 雌性不孕大鼠中MMP 均上调,推测ECM 稳态失衡,引起卵巢纤维化发展。

Ptgs2 是前列腺素合成过程中的限速酶,在炎症和有丝分裂过程中被诱导,其表达影响卵丘细胞的扩张、成熟、分化等,并在DOR 患者中表达上调[22]。黄龙[23]的研究发现,Ptgs2 在闭锁卵泡中高表达,并且促进了猪卵巢颗粒细胞凋亡。

综上所述,SSR 雌性大鼠不孕可能是由卵巢储备功能减退和卵巢低反应引起的。 250 个表达差异基因主要富集在IL-17 信号通路、p53 信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。 蛋白质互作分析结果显示,Cxcl1、Cxcl2、IL1a、IL1b、Cd80、Mmp13、Mmp8、Fgf3、Ptgs2 可能是SSR 雌性大鼠不孕的关键蛋白。 本研究结果提示SSR 雌性大鼠不孕可能与卵巢颗粒细胞纤维化或凋亡有关,进一步的具体机制研究需深入探索。