基于改良大鼠双侧颈总动脉结扎法建立血管性痴呆模型探讨脑血流量变化规律及对血管新生相关蛋白的影响

陈婕,唐鑫,陈盼,谢紫薇,谢海花,张泓,邹莹洁,谭洁

(湖南中医药大学针灸推拿与康复学院,长沙 410208)

血管性痴呆(cascular dementia,VD)是由于各种心脑血管疾病引起的脑组织病理改变进而导致的一种慢性神经退行性疾病,其特征为脑血流量减少所致的明显认知障碍[1-2],患者可能会出现思维迟钝、健忘、抑郁、焦虑、定向障碍以及执行功能的丧失等,实验中建立合适的动物模型以模拟慢性脑血量减少的病理状态,为VD 的病理生理学机制研究提供了基础[3-6]。

慢性 脑 灌 注 不 足 ( chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是导致VD 的主要原因之一,可使其脑血流量(cerebral blood flow,CBF)持续下降,造成神经血管单元失衡,产生氧化应激、神经炎症、脱髓鞘、兴奋性毒性、血脑屏障破坏等一系列损害,最终引发突触损伤、白质病变和脑萎缩等[1,7-8]。 动物实验中可通过慢性脑灌注不足的方法使脑血流量持续下降来建立VD 模型[9],改良大鼠双侧颈总动脉结扎法是建立该模型方法之一,能较稳定地表达其生理病理指标,使大鼠出现较明显的学习记忆障碍,且操作简单、死亡率低,是较理想的VD 模型建立方法[10]。 因此,探索VD 动物模型脑血流量时间变化规律及对血管新生相关蛋白的影响,对评估该病预防、用药及康复的疗效很重要。

长期慢性的脑缺血能导致缺氧,暴露于此种环境会使大鼠脑结构和功能产生适应性变化,即通过血管新生增加血管密度来缓解缺血缺氧,也许是大脑的一种血管重塑机制[11-12]。 缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor α,HIF-1α)是参与大脑血管新生和神经发生的重要调节剂,能通过调节血管新生相关因子增强血管新生,其下游血管内皮生长因子(cascular endothelial growth factor,VEGF)也是促进脑缺血后血管新生的重要蛋白,可以高效促进血管内皮细胞的有丝分裂与增殖[13-15],增加血管新生,而血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)则能在脑缺血损伤中发挥抗炎以及促血管新生的功能[16-17],三者均可在脑缺血后促进血管生成,帮助大脑重建微血管网络,缓解VD 的慢性脑缺血损伤。本研究以改良的双侧颈总动脉结扎法建立VD 大鼠模型,通过激光散斑衬比成像技术观察其造模后2 h、 3、7、14、21 d 的脑血流量变化,并检测造模后21 d 海马中血管新生相关蛋白HIF-1α、VEGF、HO-1以及血清中抑炎因子IL-4、IL-10 的含量,为防治VD持续脑血流下降进而引发的一系列病理损害提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康SPF 级雄性SD 大鼠36 只,6 ~ 8 周龄,体重180 ~ 200 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】,饲养于湖南中医药大学实验动物中心【SYXK(湘)2019-0009】,温度24~ 26℃,湿度50% ~ 70%,12 h 明暗交替环境,给予充足的食物和水。 所有操作均符合湖南中医药大学实验伦理学要求并经批准(LL-2022101204)。

1.1.2 主要试剂与仪器

2%戊巴比妥钠(Merck,P3761),IL-4 ELISA 试剂盒(Elabscience,E-EL-R0014c),IL-10 ELISA 试剂盒( Elabscience, E-EL-R0016c ), HIF-1α 抗体( Abcam, ab179483 ), VEGF-A 抗 体 ( ZENBIOSCIENCE,R26073), HO-1 抗体(Proteintech,10701-1-AP),β-tubulin 抗体(Proteintech,10094-1-AP),羊抗兔二抗(Abiowell,AWS0002a)。

激光散斑成像系统(Moor Intruments 公司,型号:Moor FIPI-2,英国),Morris 水迷宫系统(泰盟公司,型号:MT-200,中国),双臂脑立体定位仪(众实公司,型号:ZS-FDC,北京),化学发光凝胶成像仪(Bio-Rad 公司,型号:ChemiDocTMXRS + ,美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模

将36 只SD 大鼠随机分成2 组,即假手术组(n= 18)和模型组(n= 18),具体操作方法如下:

模型组:术前禁食12 h,采用改良双侧颈总动脉结扎法建立VD 模型[10]。 2%戊巴比妥0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉,大鼠仰卧位,先后于颈正中线左右旁开0.5 cm 切口,逐层分离出双侧颈总动脉,用4-0 号缝合线分别在两侧颈总动脉近心和远心端结扎,共2 次,每次打4 次结以防止线脱落,留出一段动脉以便从两端线结中间剪断颈总动脉,然后逐层缝合切口,注意无菌操作。

假手术组:仅分离颈总动脉但不结扎,其他操作与模型组一致。

成模标准:计算假手术组大鼠逃避潜伏期平均值(A)、模型组大鼠逃避潜伏期平均值(B),算出B与A 的差并与B 比较得出比值(C),即C = (BA)/B,若C ≥20%,则判断造模成功[18]。

1.2.2 成模率、死亡率及存活率统计

造模后第21 天统计模型组和假手术组的死亡率、存活率及成模率。

1.2.3 Morris 水迷宫行为学检测

采用Morris 水迷宫行为学检测在造模前和造模后第14 天[19]分别进行大鼠学习记忆能力测试。 水迷宫是一个平分为4 个象限的圆形水池,目标象限中放一个无色透明平台,加水高度为没过平台一手指厚度。 测试前在水中加入二氧化钛粉末,使平台不易被大鼠发现。 实验分为两部分:(1)定位航行实验(共5 d):每天固定时间入水,打乱每天4 个象限入水顺序,4 个象限分别入水1 次,共4 次(如第1天:1→2→3→4;第2 天:2→3→4→1),每次设置120 s,以大鼠爬上平台并停留超过3 s 耗时记作逃避潜伏期,如120 s 内未爬上平台,则引导其上平台并停留10 s,记其逃避潜伏期为120 s,计算第3、4、5天的4 个象限的平均耗时,并算出这3 d 平均耗时的平均值,即为最终逃避潜伏期。 (2)空间探索实验(第6 天): 撤去目标象限的平台,计时120 s 得出大鼠穿越目标象限平台区域的次数,记为穿越平台次数。

1.2.4 激光散斑衬比成像仪检测

2%异氟醚呼吸麻醉,使用脑立体定位仪将大鼠头部固定,于头顶正中靠近耳前位置将大鼠头部被毛除净,碘酒消毒并使用眼科剪将头顶被皮剪开约1.5 ~ 2.0 cm,以头颅前囟点和人字点为长度,两点连线左右旁开约0.5 cm 宽度作为观察范围,使用颅钻将其颅骨磨薄,以肉眼能透过颅骨看到血管为最佳观察厚度,用棉球蘸取0.9%生理盐水轻轻涂抹于暴露的颅骨,进行激光散斑衬比成像,记录其脑血流量变化图像。 使用moorFLPIReviewV50 软件对图像进行分析,在一侧大脑选择感兴趣的区域(ROI)计算出该侧大脑脑流量变化值,左右脑各取一个面积相同的区域,计算出两个区域的平均值作为最终的脑血流量变化值。

1.2.5 Western Blot 检测

麻醉方法同1.2.1,大鼠麻醉后,每组随机取6只大鼠,取双侧海马组织,将海马充分剪碎,加入裂解液,冰上静置后使用组织破碎仪破碎;离心后取上清,-80℃冰箱保存。 使用BCA 试剂盒测定浓度并配置上样缓冲液,蛋白变性、电泳、转膜,5%脱脂牛奶封闭,一抗4℃孵育过夜、二抗孵育,显影得到目的条带,使用Image J 软件分析目标条带灰度值,用目的蛋白与内参蛋白β-tubulin 比值作为其相对表达含量变化。

1.2.6 ELISA 检测

造模后21 d,麻醉大鼠,进行腹主动脉采血,每只大鼠取5 ~ 10 mL 全血,静置1 h,离心机预冷4℃,2307 r/min 离心15 min,取出上清保存,最后采用ELISA 法检测大鼠血清中IL-4、IL-10 含量,根据试剂盒说明书进行具体操作。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析,计量资料用平均值± 标准差(±s)表示。 组间比较采用配对t检验,若满足正态齐性和方差齐性则采用独立样本的t检验,若方差不齐则采用配对t′检验,若不满足正态齐性则采用Wilcoxon 秩和检验;指标随时间变化比较采用重复测量单变量方差分析。 以P< 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 成模率、死亡率和存活率统计

造模后21 d,假手术组共计死亡4 只,存活14只,死亡率为22.2%,存活率为77.8%;模型组共计死亡5 只,存活13 只,死亡率为27.8%,存活率为72.2%;模型组造模18 只,成模10 只,成模率为55.6%,见表1。

表1 各组造模后21 d 死亡、成活和成模数统计Table 1 Death, survival and vascular dementia numbers of each group were counted on 21 days after modeling

2.2 造模前后大鼠学习记忆能力比较

造模前,与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数均无显著性差异(P> 0.05)。造模后14 d,与假手术组比较,模型组大鼠的逃避潜伏期延长、穿越平台次数减少,差异具有显著性(P< 0.05),见表2。

表2 各组造模前后逃避潜伏期及穿越平台次数比较(± s, n = 10)Table 2 Comparison of escape latency and platform crossing frequency before and after modeling in each group (± s, n = 10)

表2 各组造模前后逃避潜伏期及穿越平台次数比较(± s, n = 10)Table 2 Comparison of escape latency and platform crossing frequency before and after modeling in each group (± s, n = 10)

注:与假手术组相比,*P < 0.05。 (下图同)Note. Compared with the sham group, *P < 0.05. (The same in the following figures)

?

2.3 造模前后大鼠脑血流量变化比较

组间比较发现,造模前,假手术组和模型组间大鼠脑血流量变化差异无显著性(P> 0.05);造模后2 h、3、7 d,与假手术组相比,模型组大鼠脑血流量均降低,差异具有显著性(P< 0.05);造模后14、21 d, 假手术组和模型组间大鼠脑血流量变化差异无显著性(P> 0.05),见图1。

图1 各组造模前后脑血流量变化(n = 10)Note. Compared with before modeling, #P < 0.05.Figure 1 Changes of cerebral blood flow before and after modeling in each group(n = 10)

组内比较发现,假手术组脑血流量在术后2 h开始上升,于造模后3 d 升至最高,此后开始下降,在造模后14 d 降至基线(术前)水平,造模后21 d上升至超过基线水平。 模型组脑血流量在造模后2 h 降至最低(P< 0.05),下降了约为基线(造模前)的17.56%,此后开始恢复,恢复高峰期发生在造模后3 ~ 7 d 之间,并在造模后14 d 恢复至基线水平,在造模后21 d 持续上升至超过基线水平,见图1。

2.4 造模后21 d 大鼠海马区HIF-1α、VEGF 及HO-1 蛋白表达比较

造模后21 d,与假手术组比较,模型组大鼠海马区HIF-1α、VEGF 及HO-1 蛋白表达含量显著升高,差异具有显著性(P< 0.05),见图2。

图2 各组HIF-1α、VEGF 及HO-1 蛋白表达水平(n = 6)Figure 2 Protein expression level of HIF-1α, VEGF and HO-1 in each group(n = 6)

2.5 造模后21 d 大鼠血清中IL-4、IL-10 含量比较

造模后21 d,与假手术组比较,模型组大鼠血清中IL-4、IL-10 含量升高,差异具有显著性(P<0.05),见图3。

图3 各组IL-4、IL-10 含量变化比较(n = 10)Figure 3 Comparison of IL-4 and IL-10 contents in each group(n = 10)

3 讨论

目前研究表明,脑血流量持续降低引起的慢性脑低灌注是导致血管性痴呆认知能力下降的主要驱动因素,涉及缺血、缺氧、氧化应激和神经炎症等病理动态过程[20-21],与该病的开始和进展有关,最终会损害海马体、脑白质和基底神经节等脑组织,造成认知功能障碍[22]。 持续且调节良好的血液供应是脑维持正常生理代谢的关键,其耗氧量大且只能依赖于血液供氧,即使是慢性的脑血流量下降也可能对脑功能产生无法弥补的影响,因此,检测VD脑血流量变化非常重要[22],而探究VD 在脑缺血后脑血流量时间变化规律也将有助于找到其预防和治疗的介入关键时期。

脑缺血损伤发生后的3 ~ 7 d 可能是有效治疗介入的关键时期[23-25],在此期间脑组织为了应对缺血带来的伤害,会通过增加血管新生相关蛋白的表达来促进血管生成,增加脑血流量;以往的研究也发现,VD 大鼠的脑血流量在造模后2 ~ 3 h 内会降至最低,而在造模后1 d 内开始恢复,并于造模后7 ~ 14 d 内得到显著恢复[26-28],但造模后28 d 的脑血流量仍可能低于假手术组[29]。 因此,本研究采用改良大鼠双侧颈总动脉结扎法立VD 模型,以造模前和造模后2 h、3、7、14、21 d 为观察时间点,通过激光散斑衬比成像系统检测其脑血流量时间变化规律,发现与假手术组比较,模型组大鼠的脑血流量变化在术后2 h、3、7 d 的显著降低,而术后第14、21 天的变化无显著差异,与之前的研究一致[30];组内比较发现,假手术组大鼠脑血流量在术后2 h 后开始上升,于造模后3 d 升至最高,此后开始下降,在术后14 d 降至基线(术前)水平,此后沿基线波动,这种变化可能是呼吸麻醉吸入异氟烷造成的,因其对大脑血管具有舒张作用,可使脑血流量显著增加[31-32];模型组大鼠脑血流量在造模后2 h 下降最为明显,下降值约为基线(造模前)的17.56%,此后开始恢复,恢复高峰期发生在造模后的3 ~ 7 d,但仍低于假手术组,于造模后第14 天恢复至基线水平,与先前的研究一致[26-28]。

研究发现,血管新生相关蛋白能在脑缺血后24 h 内开始表达,在脑缺血后3 ~ 7 d 便能达到峰值,其新生的血管也能在脑缺血后3 d 观察到[25-33],这与本研究的脑血流量恢复高峰期时间一致;VD 造模后2 h 脑血流量下降至最低值,为了维持正常的脑血流量,血管生成蛋白被激活以产生新的微血管,因此血管重塑能力和血管生成在此过程中被启动[29-34],脑组织通过上调VEGF 来激活脑血管生成,同时,作为缺氧基因表达的开关HIF-1α[35-36],能进一步促进VEGF 强大的血管新生作用[37],刺激内皮细胞增殖和迁移,促进新生血管发生、分化和稳定;脑缺血损伤发生时,红细胞大量破裂释放游离的血红素介导炎症反应,损伤血管内皮,HO-1 则通过分解游离血红素来降低血红素的生物利用度,产生抗氧化、抗炎以及促血管新生的效果[16-17],HIF-1α 也能介导HO-1 基因的转录激活以响应缺血缺氧,发挥其抗炎和促血管新生作用[38];因此,HIF-1α、VEGF 以及HO-1 三者同时参与血管新生过程,能促进脑血流量的恢复。 本研究发现,造模后21 d,模型组大鼠海马中HIF-1α、VEGF 以及HO-1 蛋白的表达均高于假手术组,同时,其血清中IL-4 和IL-10 的含量也出现升高,提示VD 大鼠可能通过自我修复提高HIF-1α、VEGF、HO-1 的表达来促进血管新生,并抑制神经炎症反应,进一步证实,脑缺血后,大脑可以通过血管新生蛋白的激活促进新的微血管生成[11-12],帮助脑血流量的恢复。

综上,本研究表明,改良的双侧颈总动脉结扎法建立的VD 大鼠模型脑血流量变化呈现一定时间规律,能在造模后随时间自行恢复;造模后21 d 海马中HIF-1α、VEGF、HO-1 及血清中IL-4、IL-10 的含量增加,提示VD 发病后,大脑可能通过强大的血管新生能力,促进脑血流量恢复,抑制神经炎症,减轻其认知功能损害。 VD 造模后血管新生蛋白的表达是否和脑血流量时间变化规律一致本文尚不清楚,因此,本课题组将进一步展开实验探索VD 大鼠血管新生与脑血流量变化规律的关系。