聚焦基因治疗的扩张型心肌病模型构建及进展

陈玉林蒋虎刚安涛李雯严春艳黄倩刘凯李应东赵信科*

(1. 甘肃中医药大学中西医结合学院,兰州 730000;2. 甘肃中医药大学第三附属医院,甘肃白银 730900;3. 甘肃省中医药防治慢性疾病重点实验室,兰州 730000;4. 中国医学科学院北京协和医学院国家心血管病中心阜外医院心力衰竭中心,北京 100037)

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是在没有异常负荷条件或冠状动脉疾病能够引起左心室收缩功能障碍的情况下存在左心室(left ventricle,LV)扩张和收缩功能障碍[1]。 DCM 存在病因学异质性,非遗传性占75%。 DCM 的患病率约为1/250 ~ 1/2500,在成人中发病率每年可达7/100 000,在儿童中发病率每年可达0.57/100 000,男性高于女性,且66%的儿童患有特发性疾病[2]。人DCM 遗传背景特定致病突变仍未明确,其研究也是当前热点。 心肌病的遗传复杂性挑战了传统“单基因疾病”理念,目前研究集中于“力传导缺陷”假说,未来研究希望发现遗传突变组合,理解心肌病的分子亚型[3]。 基因突变是DCM 的重要病因,核纤层蛋白A(Lamin A, LMNA)突变是导致DCM 的常见突变之一。

1 LMNA 突变是遗传性DCM 的重要病因

LMNA 突变是遗传性DCM 的重要病因。 在包含2032 名DCM 患者的研究中,导致家族及散发性DCM 病例的合并频率为5%;152 名患者中有105 名(69%)为男性;LMNA 突变携带者DCM 诊断的平均年龄为40 岁。 LMNA 突变DCM 患者的平均LVEF为 35%, 受损程度稍低; 心脏移植( heart transplantation, HTx)的平均年龄为41 岁;26%的LMNA 突变DCM 患者中进行了植入式心律转复除颤器(Implantable cardioverter-defibrillator,ICD)的植入来干预临床心律失常问题[4-7]。 LMNA 突变导致心脏损伤机制有结构假说:LMNA 突变相关层粘连蛋白结构缺陷导致细胞核结构软化和形态异常;机械转导假说:A 型层粘连蛋白突变导致收缩组织的结构调节失常,机械应力抵抗力降低;基因转录假说:Lamin A/C 能够直接结合染色质,调节其空间组织,影响转录和基因定位;线粒体功能破坏:LMNA突变导致异染色质结构和表观遗传标志物(H3K9me2/3)增加,并破坏线粒体超微结构[4,7]。LMNA 突变通过影响细胞核机械结构和基因转录导致心肌病的发生。

2 心律失常是LMNA-DCM 的重要临床表征

心律失常是LMNA-DCM 的重要临床表征。 其中包括房室传导阻滞、束支传导阻滞、窦房结功能异常的传导系统疾病占73%;心房颤动、心房扑动、室上性心动过速占61%;室性心律失常占50%;另外还有心源性猝死[8]。

3 LMNA-DCM 的突变发生率及突变类型

在一项关于LMNA 突变的临床研究中发现66名心脏移植受者或转诊心脏移植患者中有5 个突变(7.6%),另外一项研究中44 名扩张型心肌病患者中有4 个突变(9.1%)(LMNA 突变的类型及表型如表1)。 所有LMNA-DCM 都伴有不同程度的心律失常。 LMNA 突变的类型 有p. Arg541Cys、p.Arg541Gly、p.Arg89Leu、p.Val256Gly、p.Gly400Argfs*11、p.Thr510Tyrfs*42、p.Gln246*、p. Ser431*、p. Tyr481*, 其中p. Arg89Leu、p.Val256Gly、p.Gly400Argfs*11、p.Thr510Tyrfs*42、p.Gln246*、p.Ser431*、p.Tyr481*突变伴有房室传导阻滞,p.Gly400Argfs*11 突变伴有病态窦房结综合征[9]。

表1 LMNA 突变的类型及表型Table 1 Types and phenotypes of LMNA mutations

4 聚焦基因治疗的啮齿类动物DCM模型

近年来基于C57/B6 遗传背景小鼠聚焦基因治疗的啮齿类动物DCM 模型构建及其干预也是研究的热点(总结如表2)。

表2 聚焦基因治疗啮齿类动物DCM 模型Table 2 A rodent DCM model that is focused on gene therapy

对含p. H222P LMNA 突变的小鼠模型中LmnaH222P/H222P突变导致小鼠胚胎体内心脏缺陷,赖氨酸特异性去甲基化酶1 抑制剂(lysine-specific demethylase 1, LSD1 ) GSK-LSD1 挽 救 了LmnaH222P/H222P胚胎的心脏发育,且可预防小鼠的纤维化和心力衰竭,靶向组蛋白去甲基化酶LSD1 可在核纤层蛋白病小鼠模型中预防心肌病[29];对相同遗传背景的两个独立的大鼠品系,建立近端和远端TTNtv 模型(TTNtvA:A 带变异;TTNtvZ: Z 盘变异;纯合突变的大鼠无法存活,杂合突变的大鼠以正常的孟德尔比率出生)实验发现核糖体分析确定了titin 的截短变异体的翻译足迹,TTN 的近端和远端TTNtv 改变亚型加工并触发NMD,大鼠和人类的TTNtv 对心脏几何形状和功能产生不利影响,未来的研究聚焦于确定在TTNtv 和遗传或环境的二次触发相互作用中风险最大[30];对Rbm20R636Q-KO 小鼠模型,纯合子突变小鼠的短轴缩短分数显著降低表现出与DCM 一致的形态学特征[31-32]。 实验发现心脏基因的异常剪接(如TTN 突变)是RBM20 相关心肌病的主要原因,通过AAV9 对这些小鼠进行包含ABEmax-VRQR-SpCas9 和单向导RNA 的ABE 成分的全身递送,心功能恢复且寿命延长[33]。 RNAseq 显示,ABE 校正挽救了R636Q/R636Q 小鼠的心脏转录谱,全身校正ABE 减少了CMs 中存在的毒性RNP 颗粒,并挽救了小鼠的心功能障碍[34]。

5 扩张型心肌病大动物模型研究

大动物构建模型有着绝对优势,包括生理、认知能力、神经解剖学、社会复杂性、繁殖和发育等方面非人灵长类与人类具有高度相似性。 神经系统相似性:研究脑脊髓接口的可植入组件,为脊髓损伤患者的概念验证研究提供了一条实用的转化途径[35];器官解剖学相似性:基于基因编辑技术,NHPs 被用于开发模拟人类疾病(如癌症)的高效转化医学平台[36];生殖系统相似性:自体鞘膜干细胞移植可以改善NHPs 激素水平以及早发性卵巢功能不全的症状[37]。 非人灵长类动物(non-human primates, NHPs)的大型的单细胞转录组图谱已构建,包含了来自成年NHPs 食蟹猴45 个组织、113 个细胞群的超过100 万个细胞,提供了一个巨大的注释资源[38-39]。 基于超灵敏序贯荧光原位杂交(USeqFISH)的空间转录组学已开发,可用于非人灵长类动物中原位AAV 分析和多模态单细胞分析[40-41]。 在蛋白层面,反义寡核苷酸(anti-sense oligonucleotides, ASO)在NHPs 肌肉中的效力的探究:调节与血浆蛋白的结合可以以物种依赖性的方式影响ASO 活性和在肝外组织的分布,为确定增强ASO 在肌肉组织中的效力的其他策略奠定了基础[42];分泌蛋白PCSK9(LDL 受体的拮抗剂)失活对治疗高胆固醇血症的探究[43-44]:在6 只非人灵长类动物中单次输入表达靶向PCSK9 的工程巨核酸酶的AAV 载体可导致肝中PCSK9 的剂量依赖性破坏,以及循环PCSK9 和血清胆固醇的稳定减少,证明了在非人灵长类动物中具有生理学意义的高效体内编辑[45]。

大动物犬模型目前存在犬类天然DCM 模型及突变基因,易患天然DCM 的犬类有纽芬兰犬、圣伯纳犬、杜宾猎犬、大丹犬、爱尔兰猎狼犬、拳师犬、英国可卡犬,其中与人DCM 相关的基因有ACTC1、ACTN2、CSRP3[46]。 犬类模型构建方式为小剂量(0.7 mg/kg)阿霉素经5F Judkins 导管注入左冠状动脉主干,每周重复输注,持续5 周。 模型实验结果显示肌纤维萎缩和细胞质空泡化,并伴有间质纤维化,主要见于左心室;证明反复冠状动脉内灌注阿霉素是一种简单可靠的制备犬扩张型心肌病模型的方法[47]。

在关于基因突变相关的模型上,2019 年,家系研究揭示位于1 号染色体长臂的RBM20 基因第九个外显子错义突变可导致DCM[48]。 正常RBM20存在于细胞核,突变RBM20 在胞质异常聚集,突变RBM20 导致TTN、CAMK2D 等重要功能基因转录的pre-mRNA 异常剪切[49-51]。 RBM20 存在多种突变,其中位于RS 区域的最常见[50],人R636S 突变被用于DCM 猪模型,通过具有高度精确性和可控性的TALEN 基因编辑里的同源定向修复技术(HDR)引入错义突变序列(R636S)及一个防再次被切割的BglⅡ序列[51],超声显示纯合突变猪EF 值明显下降,杂合子无明显改变,MRI 也显示纯合突变猪心脏扩大,EF 下降。 新生纯合突变猪出生时心脏即明显改变:心脏体积增大,心室扩张,室壁更薄,更柔软和脆弱,心脏重量明显增加;杂合突变胞质少量聚集RBM20,纯合突变大量聚集;电镜显示肌节缩短且结构受损,心肌细胞排列紊乱。 另外参照文献[52],在iPCS 中验证了碱基编辑和先导编辑在RBM20 基因突变的效果,并进一步在其DCM 小鼠模型中得到证实,由此提出在大动物模型中是否可以有此效果,需进一步验证。 纯合突变猪生存率明显降低;猪血浆ANP 和BNP 明显增加;RBM20 纯合突变猪心肌纤维化、心肌肥大、心肌受损等相关基因上调,细胞周期、DNA 合成相关基因下调。

6 总结与展望

非人灵长类依然是更贴近人类的模型,猴在免疫相关基因表达模式和细胞通讯方面与人类的相似程度显著高于小鼠[52],目前对于非人类灵长类动物的心脏疾病模型并未涉及DCM,而猴模型是很好的大动物心脏疾病模型,但目前并未从基因层面创建DCM 模型。 目前对于DCM 的治疗集中于心衰层面,暂未发现可治疗因基因突变导致DCM 的药物,有研究利用iPSCs 表明洛伐他汀改善LMNA 心肌病的内皮功能障碍,他汀类药物可能为新的药物选择。 最新研究利用碱基编辑和先导编辑等方式修正基因突变,在小动物模型中已取得了成果,不仅在iPSC 中验证了碱基编辑和先导编辑在修正RBM20 突变的效果,还在其DCM 小鼠模型中证实了ABE 可有效修正基因突变,恢复其心脏功能并延长寿命[53]。 在今后的研究中基于基因治疗的大动物及非人灵长类模型的发展,借助高层次平台和科研团队可以从基因层面治疗DCM 实现更大的突破。