咪喹莫特联合慢性温和性不可预知应激建立斑秃样小鼠模型

吕书影,曲保全,林文君,杨顶权

(1.首都医科大学附属北京中医医院,北京 100010;2.北京中医药大学,北京 100029;3.中日友好医院,北京 100029)

斑秃(alopecia areata,AA)是一种常见的脱发疾病,临床以突发性斑片状脱发为特征,受累处皮肤无炎症及瘢痕。受累部位除头皮毛发外,也可累及身体其他多毛区域,如眉毛、睫毛、胡须、腋毛和阴毛。AA 患者常见的毛发镜特征包括黄点征、短毳毛、黑点征、锥形发、断发及感叹号样发等,其中感叹号样发为AA 的特异性毛发镜表现,断发是AA活动期的标志[1]。精神心理因素与AA 的发生发展密切相关,而疾病的临床症状又带给患者巨大的精神心理负担,进一步加剧心理问题,形成恶性循环。

建立有效的动物模型对AA 疾病的深入研究具有重要意义。目前建立斑秃动物模型的方法主要有以下五种:1994 年Sundberg等[2]发现C3H/HeJ雌鼠可出现自发斑秃表现,与人类AA 具有高度相似性,但其模型周期长、成功率低,5 月龄的C3H/HeJ 雌鼠成功率仅为0.25%,经过复杂的育种和长期培育,成功率为20%,难以满足大多数实验需求;1998 年McElwee等[3]发现通过移植自发AA 的皮损全层皮肤到10 周龄C3H/HeJ 雌鼠,可以加速脱发表型的发生;2003 年McElwee等[4]将自发AA 小鼠的淋巴结细胞在IL-7 和IL-15 条件下培养后,通过移植到C3H/HeJ 幼鼠可诱导AA 表型,但此移植方法对技术要求高,并依赖于自发的AA 小鼠,故在大规模应用上存在困难;2005 年Gilhar等[5]发现静脉注射IFN-γ 于C3H/HeJ 小鼠可诱导出与人类相似的斑秃动物模型,但鼠源IFN-γ 价格昂贵,并且有研究发现重复性不佳;2009 年杜佳等[6]使用局部外用咪喹莫特乳膏的方法,对四种品系小鼠(BARB/c小鼠、129 小鼠、C57BL/6 小鼠、C3H/HeJ 小鼠)建立了稳定的脱毛模型,成功率近100%,但未观察到毛囊周围明显炎症细胞浸润。

本研究以雌性C57BL/6J 小鼠为研究对象,采用外用咪喹莫特模拟斑秃样皮损表现,同时联合慢性温和性不可预知应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)模拟不良精神心理因素所产生的应激,共同建立情志失畅、肝郁脾虚型的AA 小鼠模型。实验以小鼠生物学表征变化、行为学表现、组织病理学改变及生化改变为观测指标,探讨AA 样小鼠模型的建立。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

5～ 7 周龄,体重16～ 20 g 的SPF 级C57BL/6J 雌性健康小鼠30 只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2021-0006】,饲养于中日友好医院临床医学研究所SPF 级别中心实验室【SYXK(京)2023-0001】,室温22～ 25℃,相对湿度50%～ 70%,昼夜光照恒定12 h/12 h,自由进食饮水,本实验获得中日友好医院实验动物福利伦理委员会审批(zryhyy21-21-07-03)。

1.1.2 主要试剂与仪器

咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司);凡士林(山东利尔康医疗科技股份有限公司);CD4+T 细胞抗体(Novus Biologicals,NBP2-46149);CD8+T 细胞抗体(Abcam,ab17147);Anti-CD4-PECyanine5.5、Anti-IFNγ-FITC、Anti-IL-4-APC、Anti-IL-17A-FITC、Anti-CD25-4E3-PE、Anti-FOXP3-APC(ebioseience,Thermofisher Scientific)。

手持毛发镜(FotoFinder);小鼠束缚器、游泳桶、50 cm × 50 cm × 25 cm 旷场(自制);旷场实验分析仪(上海欣软信息科技有限公司);光学显微镜(OLMPUS,BH-2);低温高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司,TG16 型);水平离心机(长沙英泰仪器有限公司,TD4A 型);流式细胞仪(BD,CaliburⅡ型)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及干预

小鼠适应性饲养7 d 后进行实验。30 只C57BL/6J 雌鼠随机分为空白对照组(Control 组)、咪喹莫特组(IMQ 组)、联合慢性温和性不可预知应激组(CUMS 组),每组10 只。实验1～ 11 d,Control 组及IMQ 组无特殊处理;12 d 开始Control组小鼠项背部(不剃毛)使用凡士林涂抹,IMQ 组和CUMS 组使用咪喹莫特乳膏涂抹,面积约1.5 cm ×2 cm,剂量约0.15 g,3 组均连续涂抹7 d;19 d 后停止涂抹,观察小鼠脱毛情况。上述实验过程中,CUMS 组还需持续应激21 d 制备CUMS 模型,应激因子包括倾斜鼠笼、潮湿垫子、夹尾、束缚、禁食水、频闪、游泳。实验第21 天进行取材,具体实验流程见表1。

表1 动物分组及干预方法Table 1 Animal grouping and intervention methods

1.2.2 标本采集

于第21 天对小鼠进行行为学测试,随后对小鼠进行取材。小鼠麻醉后,以眼眶静脉丛取血法采集小鼠外周静脉血,置于EDTA 抗凝管。选取背部皮肤,面积约2 cm × 2 cm,置于组织固定液中充分浸泡,准备石蜡包埋切片。

1.2.3 观测指标

(1)表观及毛发镜情况

实验期间观察各组小鼠毛发光泽程度、精神状态、活动情况、摄食情况等体征,并在实验第21 天拍摄宏观表征和毛发镜照片。

(2)行为学改变情况

旷场实验(OFT):自制一个白色旷场,长× 宽×高为50 cm × 50 cm × 25 cm,将旷场底部平均分为16 个正方形,中间4 个正方形作为旷场中心区域,外周12 个正方形作为旷场边缘区域。在避光安静环境中,将小鼠放入旷场实验箱的边缘位置,保证每只小鼠放入的角度位置相同,在每只小鼠实验结束后及时清理排泄物,并用乙醇进行消毒,以防影响之后小鼠的实验结果。实验过程中使用分析仪记录小鼠5 min 内的活动情况,手动计数直立次数[7]。

强迫游泳实验(FST):自制一个直径20 cm、高30 cm 的透明圆柱形玻璃桶,容器内注入15 cm 常温自来水。在实验过程中保持环境安静,每只小鼠放入水中后适应2 min,用摄像设备记录之后4 min内小鼠静止不动的时间,每只小鼠实验结束后均进行换水,并擦干水分。

(3)皮损CD4+、CD8+T 细胞免疫组化染色情况

①制备石蜡切片:4%多聚甲醛溶液固定后,将固定好的皮肤组织经梯度乙醇脱水,在二甲苯中透明后用石蜡浸渍包埋,注意将皮肤组织的横纵面分别包埋,然后使用切片机进行4 μm 的连续切片,切好的玻片置于75℃烤箱中过夜。

②免疫组化:二甲苯浸泡脱蜡,梯度乙醇复水后,3% H2O2氧化15 min,EDTA(pH=9.0)95℃水浴抗原热修复40 min,冷却至室温后加入10%山羊血清封闭。加入鼠抗CD4+T 细胞抗体(1 ∶150)和鼠抗CD8+T 细胞抗体(1 ∶100),4℃过夜后,加入二抗,室温孵育1～ 2 h 后用PBS 冲洗。DAB 溶液显色,脱水,封片。

(4)流式细胞术检测外周血Th1、Th2、Th17、Treg 细胞分化情况

小鼠全血样本加入Ficoll 分离液,2500 r/min离心15 min 后收集血清层和分离液层,细胞沉淀以PBS 洗涤后室温反应6 h,样本分为两管标记为1 和2,管1 加入5 μL CD4 抗体,管2 加入5 μL CD4 和CD25 抗体,室温避光反应30 min。离心沉淀后,管1加入5 μL IFN-γ、IL4 和IL17A 抗体,管2 加入5 μL FoxP3 抗体,室温避光反应30 min,使用流式细胞仪上机检测Th1、Th2、Th17 和Treg 细胞百分比。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析,数据均以平均值± 标准差()表示。两组间比较符合正态分布采用独立t检验,不符合正态分布则采用秩和检验,多组间比较采用单因素方差(Oneway ANOVA)分析,P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠表观及毛发镜情况

2.1.1 小鼠一般情况变化

实验开始时,3 组小鼠毛发均匀整齐、光泽柔顺,精神状态好,活动正常。实验第1 周,CUMS 组小鼠毛发光泽柔顺度下降,精神不佳,活动减少。实验第2 周,咪喹莫特组小鼠毛发逐渐凌乱,CUMS组小鼠精神状态持续不佳,部分出现大便变稀。第3 周,IMQ 组小鼠逐渐精神减退、体力状况下降,CUMS 组小鼠精神紧张。Control 组小鼠活动精神均正常。体重方面,Control 组小鼠体重逐渐增加,IMQ组小鼠第1 周体重逐渐增加,第2 周体重有所降低,第3 周体重较前增加。CUMS 组小鼠体重持续下降,在第2 周时体重下降最明显。从实验第1 周起,各组小鼠体重相比,差异均有统计学意义(P<0.001)(图1)。

图1 小鼠体重变化情况Note.Compared between groups,∗∗∗P <0.001.Figure 1 Body weight changes in mice

2.1.2 小鼠脱毛情况

实验第1 天,3 组小鼠毛发光泽柔顺,肤色正常,无明显脱毛区域,毛发镜下可见生长期毛发。第21 天,IMQ 组和CUMS 组小鼠背部咪喹莫特涂抹区域毛发脱落,皮肤呈浅红色,皮肤镜下可见脱毛与正常毛发区域交界处断发,CUMS 组更为明显,更有感叹号样发、黑点征,部分小鼠皮损区域出现少许鳞屑(图2)。

图2 各组小鼠毛发情况Note.A.Hair overall changes.B.Hair trichoscopic changes.Figure 2 Mice hair in each group

2.2 小鼠行为学改变情况

旷场实验结果显示,小鼠移动距离方面,与IMQ组相比,Control 组小鼠移动距离无明显差异,CUMS组小鼠5 min 内移动距离明显减少,同时与IMQ 组相比,也具有显著性差异,表明CUMS 组小鼠自主活动能力降低。小鼠直立次数方面,与IMQ 组相比,Control 组小鼠直立次数无明显差异,CUMS 组小鼠直立次数明显减少,同时与IMQ 组相比,也具有显著性差异,表明CUMS 组小鼠具有严重的焦虑抑郁情绪。小鼠进入中央区域次数方面,与IMQ 组相比,Control 组小鼠进入中央区域次数较多,但无明显统计学意义,CUMS 组小鼠较IMQ 组小鼠进入中央区域次数更少,差异具有显著性,表明CUMS 组小鼠处于严重焦虑恐惧状态,探索能力降低(表2)。

表2 各组小鼠行为学改变情况(,n=8)Table 2 Mice behavioral changes in each group (,n=8)

表2 各组小鼠行为学改变情况(,n=8)Table 2 Mice behavioral changes in each group (,n=8)

注:与IMQ 组相比,∗P <0.05,∗∗P <0.01,∗∗∗P <0.001。(下图同)Note.Compared with IMQ group,∗P <0.05,∗∗P <0.01,∗∗∗P <0.001.(The same in the following figures)

强迫游泳结果显示,与IMQ 组相比,Control 组小鼠静止不动时间无明显差异,CUMS 组小鼠静止不动时间明显增加,表明小鼠产生绝望情绪。与IMQ 组相比,CUMS 组小鼠静止不动时间同样具有显著性差异(表2)。

2.3 小鼠皮损CD4+、CD8+ T 细胞免疫组化染色情况

各组小鼠背部皮损的免疫组化染色结果显示,CUMS 组小鼠CD4+、CD8+T 细胞在毛囊周围及毛囊球部表达,较Control 组及IMQ 组染色更为明显,而IMQ 组小鼠皮损毛囊周围CD4+、CD8+T 细胞表达较Control 组无明显增加,表明外用咪喹莫特联合CUMS 的应激方法较单纯外用咪喹莫特干预更促使毛囊周围淋巴细胞浸润,贴近AA 的组织病理学改变(图3)。

图3 各组小鼠皮损CD4+、CD8+ T 细胞免疫组化染色情况Figure 3 Immunohistochemical staining of CD4+ and CD8+ T cells in skin lesions of mice in each group

2.4 小鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg 细胞分化情况

与IMQ 组相比,Control 组小鼠Th1 细胞和Th1/Th2 细胞比率显著较低。与IMQ 组相比,CUMS 组小鼠Th1 细胞显著升高(P<0.01),Th2细胞显著降低(P<0.05),Th1/Th2 细胞比率显著升高(P<0.001)(表3)。

表3 小鼠外周血Th1、Th2、Th17 和Treg 细胞分化情况(,%,n=6)Table 3 Differentiation of peripheral blood Th1、Th2、Th17 and Treg cells in mice (,%,n=6)

表3 小鼠外周血Th1、Th2、Th17 和Treg 细胞分化情况(,%,n=6)Table 3 Differentiation of peripheral blood Th1、Th2、Th17 and Treg cells in mice (,%,n=6)

注:与IMQ 组相比,∗P <0.05,∗∗P <0.01,∗∗∗P <0.001。Note.Compared with IMQ group,∗P <0.05,∗∗P <0.01,∗∗∗P <0.001.

与IMQ 组相比,Control 组小鼠Th17 和Treg 细胞水平,以及Th17/Treg 细胞比率均显著较低。与IMQ 组相比,CUMS 组小鼠Th17 细胞显著升高(P<0.05),Treg 细胞有升高趋势,Th17/Treg 细胞比率较高,但无明显差异(表4)。

3 讨论

咪喹莫特是一种免疫反应调节剂,可以增强先天性和获得性免疫反应,目前主要被广泛地应用于银屑病动物模型。赵恒光[8]通过单独外用咪喹莫特建立了稳定高效的C3H/HeJ 小鼠AA 动物模型,进一步研究证实在C57BL/6 等多品系小鼠中也可建立与人类AA 类似的脱毛小鼠模型,其机制可能与咪喹莫特诱导激活毛囊周围的TLR7 受体有关[6]。

CUMS 是一种经典的抑郁症动物模型造模方法,通过各种应激因子模拟人类在日常生活中的不良应激事件,从而导致焦虑抑郁状态。而中医理论中情志异常、肝失疏泄的作用机制与病理性心理应激之间存在着密不可分的联系[9]。因此,目前这一造模方法不仅应用于抑郁症的动物研究,而且越来越多地联合应用于各类肝郁气滞型疾病的动物模型。相较于其他心理应激造模方法,CUMS 中不同应激因子交替随机出现,可避免动物习惯性适应,更好地达到不可预知效果。

本研究运用咪喹莫特乳膏外用联合CUMS 的造模方法,通过对比单独外用咪喹莫特乳膏,探讨建立一种更贴近中医理论肝郁脾虚型的AA 小鼠模型。这种病证结合的动物模型更符合中医辨证论治的治疗理念,对中医药治疗AA 的深入研究极为重要。

小鼠一般情况方面,CUMS 组出现大便稀溏、体重下降的情况,这与中医肝气乘脾土关系密切,肝气郁结导致脾运化失司,故而大便稀薄不成形。IMQ 与CUMS 组小鼠体重均有所下降,可能与IMQ引起的免疫反应相关,其中CUMS 应激会导致体重下降地更为明显,推测与应激刺激导致的食欲减退等有关。

动物行为学能够反映其精神心理状态。旷场实验是一种测试小鼠自发活动行为和探索行为的行为学方法,主要通过观察小鼠运动行为的变化情况来判断认知能力、紧张度和兴趣度等。在实验过程中,对新异环境的恐惧会导致小鼠主要在旷场箱内周边区域活动,而好奇和探索心理会驱使小鼠在旷场中央区域活动[10]。强迫游泳实验是一种测试小鼠是否处于绝望状态的行为学测试方法。当小鼠被置于圆柱形容器内被迫游泳时,最初往往表现为挣扎剧烈、向上尝试逃脱容器,当尝试失败后便放弃挣扎,保持头部露出水面而肢体静止不动的状态,即“行为绝望”[11]。本研究发现联合CUMS 应激小鼠在5 min 内在旷场的移动距离、直立次数和进入中央区域次数显著少于空白对照组和咪喹莫特组小鼠,在水中静止不动的时间显著长于另外两组,表明CUMS 导致小鼠自发活动和探索行为减少,对周围事物好奇心减弱,容易陷入绝望状态,产生了明显的焦虑抑郁情绪,与先前的研究结果一致。

目前AA 动物模型为病理性模型[12],对其评价主要通过现代医学指标,包括表观指标、病理指标及生化指标等。宏观表征方面,通过3 周的CUMS应激,发现CUMS 组小鼠精神状态差,大便稀薄,体重较单独外用咪喹莫特组明显下降,毛发干枯脱落速度快、程度重,表明联合CUMS 的造模方法促进小鼠出现情志异常、肝郁脾虚的表现。毛发镜表现方面,研究结果显示联合CUMS 的造模方法较单独外用咪喹莫特乳膏,加速了小鼠毛发脱落,毛发镜下观察到更明显的人类AA 的特征性改变,如断发、感叹号样发,证明联合CUMS 的应激方法能够加快疾病的进展。吕晴[13]的研究也证实了CUMS 能较好模拟机体应激反应,可加重AA 模型小鼠毛发脱落。

AA 的发病与免疫调节失衡密切相关,毛囊周围和毛囊内的CD4+和CD8+T 细胞浸润是AA 的特征性改变。本研究通过对小鼠皮损进行CD4+、CD8+T 细胞免疫组化染色,结果显示联合CUMS组小鼠毛囊周围及毛囊球部CD4+、CD8+T 细胞浸润明显,贴近AA 的组织病理学改变。流式细胞结果显示CUMS 组小鼠的Th1 水平明显升高(P<0.01)、Th2 水平明显降低(P<0.05)、Th17 水平明显升高(P<0.05)、Th1/Th2 细胞比率明显升高(P<0.001)、Th17/Treg 比例有上升趋势,据此推测CUMS 的应激方法可加重小鼠的免疫调节紊乱,进而加重脱毛。

4 结论

通过咪喹莫特乳膏外用联合CUMS 的造模方法,小鼠毛发脱落明显,疾病进展快,毛发镜下可见断发、感叹号样发,行为学测试表现出明显的焦虑抑郁状态,皮损中毛囊周围及毛囊球部CD4+、CD8+T 细胞浸润,外周血Th1、Th17 水平及Th1/Th2 细胞比率明显升高,Th17/Treg 比例有上升趋势,Th2 水平明显降低,与人类AA 疾病改变相似。

由此可见,咪喹莫特乳膏外用联合CUMS 可诱导C57BL/6J 小鼠建立AA 样动物模型,这种造模方法在先前研究基础上突出了AA 发病机制中精神心理因素的作用,一定程度上模拟了中医肝郁脾虚证的临床表现,同时C57BL/6J 小鼠较C3H/HeJ 小鼠价格更低,培育方便,为AA 提供了一种新的更具性价比的动物模型。