溃疡性结肠炎动物模型的特点及应用分析

周欣欣,刘茜茜,任珍,蒋鑫,白莉,苗明三

(河南中医药大学药学院,郑州 450046)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是由多因素、异常免疫介导的一类肠道疾病。目前尚未明确其发病机制,多数学者认为UC 的发病机制主要与遗传、感染、免疫及精神等多种因素有关,尤以免疫学的改变为主[1-2]。UC 发生后严重影响患者的日常生活及心情,治愈率低且易复发,因此寻找更好的治疗方法迫在眉睫。动物实验是药效验证和机制研究的关键环节,建立符合临床病症发生特点的动物模型至关重要,现多以化学刺激等方法进行造模,并新增免疫复合法、中医因素造模法等通过免疫因素及中医影响因素进行造模的方法。本文通过数据挖掘UC 动物实验相关文献,整理各种UC 动物模型的造模方法、检测指标等内容,为建立更加理想的UC 动物模型、为后续实验研究及新药开发提供新思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源

以“溃疡性结肠炎”和“动物”为主题,在中国知网数据库高级检索界面选定期刊项进行检索,时间范围为2012 年1 月～ 2022 年7 月,总查询到期刊文献1014 篇。

1.2 纳入和排除标准

选择研究溃疡性结肠炎完整动物实验文献纳入范畴;排除综述类和资料不全的文献。最终筛选出符合纳入标准的文献580 篇,将文献中实验动物品系、性别、应用类别、造模方法、检测指标等录入Excel 2017 进行总结处理,以此创建溃疡性结肠炎动物模型的数据库。

2 结果

2.1 动物品系应用情况

将检索的580 篇实验文献中的实验动物品系进行分类处理,整理共得出13 类实验动物,同一文献中记载的多个动物品系均统计在内(其中有3 篇文献记载两种动物品系;9 篇文献中未明确记录实验动物品系,故不统计),累积频率共574 次。从其结果分析可以看出,使用品系最多的为SD 大鼠,详情见表1。

表1 溃疡性结肠炎模型动物品系分布Table 1 Distribution of animal strains in the ulcerative colitis model

2.2 动物性别分布情况

对纳入文献的动物性别进行统计,文献出现多次动物性别则全统计在内,共计频次551 次(其中有3 篇文献记载两种动物及性别;有30 篇未对动物性别做出说明、2 例表述不准确,故不做统计),其中雄性(355 例,64.43%),雌雄各半(148 例,26.86%),雌性(43 例,7.80%),雌雄不拘(5 例,0.91%),实验动物性别分布情况见图1。

图1 实验动物性别分布情况Figure 1 Gender distribution of experimental animals

2.3 造模方法

将检索到的580 篇文献中的造模方法进行统计,得到单纯化学刺激法、复合法、免疫复合法、中医因素造模法四类造模方法,共计频次582 次,同一篇文献出现多种方法全记录在内(其中有两篇文献记载两种造模方式),目前文献中采用较多的方法是TNBS-乙醇溶液灌肠法231 例,占比39.69%,不同浓度DSS 自由饮用225 例,占比38.66%,二者是目前较为公认的造模方法,近年来,基于中医药基础指导下的动物模型逐渐增多,例如脾虚型与湿热蕴结型等。表仅统计频次≥4 的造模方法,具体结果见表2。

表2 常见UC 造模方法统计表Table 2 Statistical table of common UC modeling methods

2.4 模型应用分析

目前,对于UC 动物实验研究主要集中在药效验证与机制分析,在纳入统计范围的580 篇文献中,药效验证269 篇(占比38.71%),机制研究381篇(占比54.82%),模型建立与验证45 篇(占比6.47%),各类使用最多的模型类型详情见图2。从图中可以看出,DSS 自由饮用和TNBS-乙醇溶液灌肠是机制研究和药效验证应用最广泛的模型。此两种造模方法操作简单、模型稳定性好、使用频率高,对于药效验证和机制研究等应用最广,但目前对于免疫通路或中医相关机制的研究常以此两种方法为基础进行造模研究。

图2 UC 动物模型药效、机制研究占比Note.A.Percentage of modeling methods for pharmacodynamic validation.B.Percentage of modeling methods for mechanistic studies.C.Percentage of research directions.Figure 2 Percentage of studies on the efficacy and mechanism of UC animal models

2.5 检测指标

将检索到的580 篇实验文献中的全部检测指标进行归纳整理。在检测指标中,同一组织有多个检测指标,则分开统计,如结肠组织既做病理观察又进行生化检测;多种检测方法检测同一组织的多个同类型指标,则将其归为一类,合并统计,如结肠组织中进行Western Blot 及免疫组化蛋白检测等,则把这些指标统称为结肠组织蛋白检测,同一实验只计入1 次。结果表明,580 篇实验文献检测指标出现频次1974 次。其中检测较多的指标为结肠病理(269 次,13.63%)、DAI 评分(246 次,12.46%)、一般情况(231 次,11.70%)、血清生化指标(225 次,11.40%)、结肠组织蛋白表达(171 次,8.66%)等。下表仅统计出现频次≥10 的检测指标,详见表3。

表3 检测指标分类及分布情况Table 3 Classification and distribution of detection indicators

3 讨论

3.1 动物品系及动物性别的选择

已有的溃疡性结肠炎动物模型构建以大、小鼠为主,鼠类在孕育周期、实验价格、操作过程等方面更具优势。其中使用最多的为SD 大鼠、Wistar 大鼠,炎症部位易于观察,在实验过程中便于操作。小鼠易于饲养,对多种病菌、病毒及化学品的刺激反应敏感,但死亡率较大鼠高[25],使用频率低于大鼠;既往实验中溃疡性结肠炎实验动物常需选择雄性动物,可能与体内雌激素水平改变,引起炎症因子的变化有关[26]。

3.2 造模方法的选择

建立与临床病症相似的动物模型有助于其机制研究及新药开发。自发性及基因工程动物模型更贴近临床疾病的发生,但自发性溃疡性结肠炎模型,病情轻重不一,实验时较难控制;基因工程模型价格昂贵、来源较少,故实验中仍需人工加以复制。建立溃疡性结肠炎模型主要是使动物的大肠黏膜及黏膜下层发生慢性非特异性炎症改变[27],结肠的组织病理改变,模仿疾病临床发生过程。从已有文献来看,无论是药效验证还是机制分析,目前UC 的造模方法主要集中在TNBS-乙醇溶液灌肠、DSS 自由饮用两种造模方法。TNBS-乙醇溶液灌肠诱导UC 模型的机制可能为[28]动物肠壁接触乙醇会导致其粘膜屏障受损,造成不同程度肠粘膜的损伤,而TNBS 作为半抗原与体内蛋白结合形成全抗原后产生一系列的肠道免疫反应及炎症反应,诱发UC 炎症[29];TNBS-乙醇溶液灌肠法造模方法简单、性价比高、成模率高、炎症持续时间长,适用于研究慢性复发性的UC;其次为DSS 自由饮用,其诱导机制可能为DSS 作为一种硫酸多醣具有抗凝血作用,可破坏结肠上皮屏障的完整性,增加肠粘膜通透性,从而导致多糖等大分子物质更易渗入肠粘膜组织中,引发一系列炎症反应[30],且其抗凝血功能增强可能导致肠道出血[31],DSS 自由饮用法造成的动物模型的病理表现与人类UC 临床表现相似,且该造模方法成模率高、易于操作、可重复性强[32]。这两种造模方法均可在短时间内破坏肠粘膜屏障通透性,使结肠部位发生严重炎症,诱导出近似人临床病理相似的表现。基于这两种造模方法稳定且可重复性强,在建立新的在造模方法时,常以此为基础进行改造。

众多实验研究表明溃疡性结肠炎的发生与免疫系统密不可分,造模时添加免疫因素已成为UC造模时常用手段。抗原常选用患者结肠或兔结肠,制备成抗原乳化液,注射动物足跖、腹股沟、背部皮下及腹腔造成免疫过度或者无节制免疫反应,再联合化学刺激诱导的溃疡性结肠炎模型,使动物局部炎症病变与全身异常免疫变化相结合,尽可能与人类自然发生UC 的病变特点相贴合[33-34],此模型的病变持续时间较长,与人类UC 免疫发病机制较为相似;但其有操作繁琐、造模时间长等缺点,需分批多次注射抗原以维持其致敏状态。中医药对于此类慢性肠炎性疾病有良好的疗效,近年来添加中医因素造模也越来越多[35],中医上本无“溃疡性结肠炎”记载,根据其病因病机常将其归属为“肠癖”“痢疾”等,参照《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见(2017)》《消化系统常见病溃疡性结肠炎中医诊疗指南》(基层医生版)[36]将其分为大肠湿热证、脾肾阳虚证、热毒炽盛证、肝郁脾虚证、脾虚湿蕴证、寒热错杂证、阴血亏虚证7 类,可见UC 具有“湿”、“热”、“虚”的特点,且与大肠、脾、肝等脏腑相关,在使用中医因素造模时,多使用番泻叶、大黄等泻下药灌胃造成脾虚,高脂高糖饮食造成大肠湿热,捆绑束缚造成肝郁等。使用中医因素造模,更贴近临床疾病的发生,促进中药新药的开发与研究,但由于动物与人存在较大差异性,病证结合动物模型的建立仍存在许多问题[37]。

3.3 检测指标的选择

在溃疡性结肠炎模型造模之后,动物出现血便、黏液稀便、状态明显变差及病变部位病理学改变。根据统计发现,检测指标特主要围绕行为学指标、病变部位相关结肠病理、mRNA 表达、结肠组织、血清中细胞因子表达等方面进行。行为学指标包括比较给药前后一般情况评价(包括大鼠精神状态、纳食情况、粪便性状、运动量、体重等生理活动变化情况)、DAI 评分,可初步了解动物病症发展的严重程度。根据统计结果发现使用不同方法检测结肠病变组织的相关蛋白质表达是占比较高的检测指标,其中以髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)[38]、NF-κB p65 等相关蛋白研究较多,普遍存在于真核细胞的一种转录因子为核因子(NF-κB),在炎症及免疫反应中用于调节炎症和免疫相关因子及炎症递质的表达。NF-κB 在UC 中呈现过度激活状态,并过度释放黏附分子及细胞因子,从而扩大炎症反应[39]。研究发现肠道黏膜感染的标志物为NF-κB,因此NF-κB 的含量与疾病的严重有关[40]。中性粒细胞在炎症组织中浸润程度的重要指标之一是MPO 活性[41],文献研究表明,UC 患者及UC 大鼠模型肠道MPO 水平正常比对照组明显升高[42];在进行病理观察时首先会进行结肠大体形态损伤指数(CMDI)或结肠损伤指数(TDI)的评价及病理组织学(HS)的评价,再进行HE 染色进行显微镜下观察,可确认动物炎症病变程度及评价药物的疗效。从纳入范围的580 篇文献中可知,结肠组织及血清中所检测生化指标较多的是IL-4、IL-6、IL-10、IL-8、IL-17、TNF-α、IFN-γ、CRP、IgG 等,这些细胞因子包括炎症因子及抗炎因子,可以有效反映炎症的发生。肠炎的发生与肠道菌群状态联系紧密,溃疡性结肠炎患者常出现不同程度的肠道菌群失调,而粪便球杆比失衡是菌群失调患者最早表现之一,粪便球杆比能够及早判断其菌群比例[43],因此分析肠道菌群的菌群特点可判断迅速UC 的发生。

本文通过对近10 年有关溃疡性结肠炎动物模型文献的整理与研究,总结了UC 常用动物实验的造模方法及检测指标,比较不同造模方法对模型成功率的影响,结果建议在溃疡性结肠炎动物模型中选用雄性SD 大鼠和Wistar 大鼠;造模方式选择TNBS-乙醇溶液灌肠和DSS 自由饮用法造模;检测指标选择结肠组织病理学、DAI 评分、一般情况、血清生化指标、结肠组织蛋白表达等。希望本文可以为建立更理想的动物模型提供依据,并促进临床对溃疡性结肠炎的研究与发展。