间充质干细胞衰老的表观遗传学研究进展

孟博,杨盛,彭晴,赵文杰,张钰,胡满,刘鑫,张亮∗

(1.大连医科大学研究生院,辽宁 大连 116044;2.扬州大学临床医学院,江苏 扬州 225001)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类来源于中胚层的多能干细胞,1987 年Friedenstein等[1]首先在小鼠骨髓中发现MSCs,后有学者陆续发现MSCs 也存在于肌肉、脂肪、椎间盘、脐带及牙髓等其他组织中[2-6]。MSCs 具有高度的自我更新能力、多向分化潜能及低免疫原性,因此是用于组织修复的理想细胞来源。但由于MSCs在临床应用中需要体外扩增,从而不可避免的面临细胞衰老问题,进而一定程度上限制了其在临床的广泛应用[7]。MSCs 衰老的机制十分复杂,本文将近年来与MSCs 衰老相关的表观遗传修饰方面的研究进行综述,探讨表观遗传修饰对MSCs 衰老的影响,以期为今后的基础研究和临床应用提供一种新思路。

1 细胞衰老

细胞衰老是指细胞在执行生命活动过程中,随着时间推移,细胞增殖与分化能力及生理功能逐渐衰退的变化过程。细胞衰老现象首先于1965 年被美国生物学家Hayflick[7]在培养肌成纤维细胞过程中发现,即细胞在体外培养时,经过有限次数增殖,即使给予最适宜的培养环境,细胞经过一定代数的分裂后也会发生衰竭,从而进入到一种不可逆的细胞周期停滞状态,此种细胞增殖能力的极限被称为Hayflick 极限。当细胞复制次数到达Hayflick 极限后,细胞就会发生衰老,最终通过启动凋亡而死亡[7]。Hayflick 极限能够阻止正常细胞的无限增殖。

复制性衰老的细胞通常表现为细胞增殖率降低,细胞形态增大及端粒缩短[8]。细胞发生衰老后,细胞膜、细胞质及细胞核等均会发生明显变化,如:(1)细胞含水量下降,体积变小,新陈代谢速度减慢;(2)细胞内酶活性降低;(3)细胞内色素沉积;(4)细胞呼吸速率下降,细胞核体积增大,线粒体数量减少,体积增大;(5)细胞膜通透性功能改变,物质运输功能降低。衰老现象是所有细胞共同具有的特性,MSCs 作为细胞的一种,同样面临衰老问题。由于体内可直接提取的MSCs 数量较少,难以达到临床应用的数量标准,故在临床应用过程中MSCs 常需体外扩增培养。然而由于存在Hayflick极限,随着细胞传代次数增多,MSCs 不可避免的面临衰老问题,使其生物学功能下降甚至失调,限制了临床应用。

细胞衰老是多种因素共同作用的结果,是一个复杂的综合生物进程。目前细胞衰老机制的研究主要集中于端粒与端粒酶学说、氧化应激损伤、DNA损伤、Wnt/β-catenin 通路激活、SIRT 家族蛋白及表观遗传调控等方面[9-11]。本文主要从表观遗传方面阐述MSCs 衰老的机制。

2 表观遗传调控

表观遗传调控是指在不改变基因序列的情况下,基因表达发生可逆的、可遗传的变化。经过表观遗传修饰,DNA 的空间结构或者染色体结构发生改变,导致基因沉默或过表达。近年来研究证实表观遗传调控与多种代谢性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤等密切相关[12-14]。表观遗传修饰可通过3 种方式改变基因表达:DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA。

2.1 DNA 甲基化修饰

DNA 甲基化修饰在真核生物中是十分常见的复制后修饰,是哺乳动物基因表达调控的主要表观遗传学形式。DNA 甲基化是指在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的参与下,在基因组CpG 二核苷酸的胞嘧啶5 号碳位共价键结合一个甲基基团,甲基供体通常来源于S-腺苷甲硫氨酸。DNA 甲基化通常会抑制或沉默基因表达,从而改变细胞生理功能[15]。

Farahzadi等[16]通过具有抗衰老作用的L-肉碱处理脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs),结果发现hTERT启动子区CpG 岛的甲基化状态发生改变,总的甲基化水平降低,端粒酶活性增加,最终导致ADMSCs 衰老程度显著降低,因此推测hTERT 启动子区甲基化能够促进ADMSCs 衰老。但由于在此研究中端粒酶活性的增加同样可以延缓细胞衰老进程,因此并不能充分说明相关基因的甲基化会促进ADMSCs 衰老。Kornicka等[17]通过DNA 甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-AZA)处理ADMSCs,并通过ELISA 定量评估DNA 甲基化状态,结果发现DNA 甲基化水平明显降低,β-半乳糖苷酶阳性染色细胞数量明显减少,说明5-AZA 能有效抑制ADMSCs 衰老,但其具体机制有待进一步研究。Oh等[18]通过DNA 甲基转移酶抑制剂RG108 处理人骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived stem cells,BMSCs),结果发现抗衰老基因端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)、成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管紧张素(angiotensin,ANG)表达增加,而衰老相关共济失调毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasiamutated gene,ATM)、p21 及p53 表达降低,且β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数量显著减少;因此说明RG108 通过对TERT 启动子区域的去甲基化作用,解除甲基化对TERT 表达的抑制,延缓端粒短缩速度,从而有效保护细胞衰老。有学者通过5-AZA/白藜芦醇联合用药探究二者对ADMSCs 的影响,结果发现二者联合能够明显降低DNA 中的5-甲基胞嘧啶水平,从而在一定程度上延缓MSCs 衰老[19]。

综上可知,衰老相关基因的甲基化水平增加能够加速MSCs 衰老进程;反之,抑制衰老相关基因的甲基化能够延缓甚至逆转MSCs 衰老。

2.2 组蛋白修饰

组蛋白是一种存在于染色体内的与DNA 结合的碱性蛋白质,富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸,与DNA 共同组成核小体结构。染色体是由重复单位核小体组成。每一核小体包括:一个核心8 聚体(由4 种核心组蛋白H2A、H2B、H3 和H4 的各两个单体组成);长度约为200 个碱基对的DNA 以及一个单体组蛋白H1。长度为147 碱基对的DNA 盘绕于核心8 聚体外面。在核心8 聚体之间则由长度约为60 个碱基对的“接头”DNA 连接[20]。组蛋白在维持染色体结构稳定方面发挥重要作用。组蛋白修饰是指在相关酶的作用下发生甲基化、乙酰化及磷酸化等过程,是一种常见的翻译后修饰。其中,组蛋白的甲基化修饰是最稳定的修饰方式,通常发生在赖氨酸残基和精氨酸残基上。而乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化及ADP 核糖基化等修饰具有较高动态。这些修饰能够更加灵活的影响染色质的结构与功能,通过多种修饰方式的组合发挥调控功能。

既往研究表明组蛋白修饰特别是组蛋白甲基化与乙酰化参与MSCs 衰老相关病理过程。Xu等[21]研究发现在早期传代的BMSCs 中,精氨酸甲基 转 移 酶 1 (coactivator-associated arginine methyltransferase 1,CARM1)与H3R17 甲基化水平较高的盘状结构域受体2(discoidin domain receptor 2,DDR2)启动子区域直接结合;与早期传代细胞相比,晚期传代细胞中DDR2 表达减少,敲除DDR2 后可以削弱早期传代细胞的自我更新能力;CARM1 能够在早期传代细胞中优先甲基化H3R17,抑制CARM1 介导的组蛋白精氨酸甲基化可以降低DDR2 表达并导致细胞衰老;过表达CARM1 或DDR2 可以延缓晚期传代细胞的衰老。该研究表明在不同的细胞培养周期中,CARM1 介导的H3R17甲基化对骨髓间充质干细胞衰老会产生不同作用,但具体机制仍有待进一步研究。Huang等[22]报道H3K9 去甲基化酶(KDM3A 和KDM4C)在BMSCs衰老过程中通过转录激活凝集素成分NCAPD2 和NCAPG2 调节异染色质重组;抑制KDM3A/KDM4C或NCAPD2 可引起强烈的DNA 损伤反应,从而加剧细胞衰老;而过表达KDM3A/KDM4C 或NCAPD2则可以促进异染色质重组,使DNA 损伤反应钝化,从而能够延缓或减弱MSCs 衰老。Hu等[23]研究发现衰老BMSCs 中NAP1L2 蛋白表达增加,而NAP1L2 表达量与H3K14 乙酰化水平呈明显负相关;进一步研究发现,NAP1L2 通过调控H3K14 乙酰化NF-κB 通路调控衰老相关表型表达促进BMSCs 衰老。有学者通过WNT10A 诱导大鼠骨关节炎滑膜间充质干细胞衰老,结果发现WNT10A 通过Wnt/钙通路介导组蛋白去乙酰化酶HDAC5 磷酸化,使得HDAC5 胞质异位,增加细胞核内P53 的乙酰化水平,从而加速细胞衰老[24]。另外,Wang等[25]在衰老MSC 模型中发现编码一种组蛋白乙酰转移酶的基因KAT7 表达上调,KAT7 失活能够使H3K14 的乙酰化水平下调并抑制p15 INK4b 转录,从而延缓细胞衰老。

总体来说,目前关于组蛋白修饰的研究主要集中于组蛋白甲基化及乙酰化方面,对于组蛋白其他类型修饰的作用机制及涉及的信号转导通路认识有限,有待于进一步研究。

2.3 非编码RNA

非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)是指不编码蛋白质的RNA,人类基因组中大多数RNA 均属于非编码RNA。非编码RNA 包括核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)、转义RNA(transfer RNA,tRNA)、核小RNA(small nuclear RNA,snRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)等。非编码RNA 的表观遗传修饰包括由外源RNA 分子(小干扰RNAs 或siRNA)或内源性RNA 分子(microRNAs)介导的调控修饰[26]。近年来关于RNA 甲基化的研究逐渐成为热点。有学者研究发现敲除m6A 甲基转移酶METTL3 可以促进MSCs 衰老,而过表达METTL3 则可以在一定程度上逆转MSCs 衰老;进一步研究发现衰老MSCs 中MIS12 的mRNA 含量明显降低,这是由于缺乏m6A 修饰导致MIS12 mRNA 的周转速度加快所致,从而加速细胞衰老[27]。因此说明METTL3 能够通过m6A 修饰增加MIS12 转录本的稳定性来延缓MSCs 衰老[27]。Sun等[28]分别从年老和年轻大鼠中提取BMSCs,通过高通量测序和生物信息学进行分析,结果发现4229 个circRNAs 参与MSCs 的年龄相关性衰老;并且与年轻组比较,年老组中有29 个差异表达的circRNAs,其中4 个上调,25 个下调。因此差异表达的circRNA 可能在与年龄相关的MSCs 衰老中发挥重要作用,但具体机制缺乏进一步研究。Li等[29]研究发现髓核细胞与BMSCs 共培养后,可以通过上调RNA 去甲基化酶ALKBH5 调控髓核细胞的自噬,保护FIP200 mRNA免受m6A“阅读器”YTHDF2 介导的降解,从而抑制压应力导致的髓核细胞凋亡。另外,Cai等[30]研究发现与野生型相比,长链非编码RNA 基因Gm31629敲除小鼠的BMSCs 衰老明显增加,从而导致骨再生修复受损;进一步研究发现Y-box 蛋白1(YB-1)可与Gm31629 相互作用并延缓其降解,降低p16 INK4A 转 录 从 而 延 缓 BMSCs 衰 老。此 外,microRNA 对调控MSCs 衰老也是目前研究热点。Xu等[31]发现老年大鼠BMSCs 衰老表型增加与miR-31a-5p 的上调有关。研究表明miR-31a-5p 与E2F2 的3’UTR 直接结合,促进细胞中衰老相关异染色质灶(SAHF)的形成调节细胞衰老。有学者发现过表达miR-141-3p 可抑制牙根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs)增殖以及加速SCAPs衰老[32]。生物信息学及双荧光素酶分析miR-141-3p通过下调下游靶基因Yes-associated protein (YAP)抑制SCAPs 的增殖并加速SCAPs 的衰老[32]。Fafián-Labora等[33]发现抑制大鼠BMSCs 来源外泌体中miR-188-3p 表达能够增加老年大鼠BMSCs 中Rictor水平,AKT 磷酸化水平降低,抑制BMSCs 衰老。另外有学者发现miR-155-5p 可通过AMPK 信号通路抑制MSCs 的线粒体裂变加速细胞衰老[34]。

目前关于非编码RNA 的表观遗传调控与MSCs衰老的相关性研究多集中于m6A、circRNA 以及microRNA。而circRNA 与microRNA 在MSCs 衰老调控中的相互作用仍有待进一步完善研究(见表1)。

表1 表观遗传修饰在MSC 衰老中的调控网络Table 1 Regulatory networks of epigenetic modifications in MSC senescence

3 结语与展望

综上所述,表观遗传学修饰在调控MSCs 衰老过程中发挥重要作用。目前关于MSCs 衰老与表观遗传学的研究尚处于起步阶段,研究多集中在其多向分化调控上。间充质干细胞的分化方向如成骨、成脂分化与其衰老密切相关。许多表观遗传调控间充质干细胞衰老同时伴随着成骨及成脂分化的调控。如表观遗传调控促进间充质干细胞衰老的同时,往往伴有成骨分化能力减弱以及成脂分化能力增加,反之亦然。但关于二者之间的机制还有待进一步研究。另外,circRNA 作为microRNA 的上游调控位点,在microRNA 调控中发挥分子海绵机制,在microRNA 对于间充质干细胞衰老相关文献中并未进行深入研究。笔者相信,随着研究不断深入,表观遗传调控MSCs 衰老的神秘面纱会被逐渐揭开。届时,可以通过表观遗传学延缓甚至逆转MSCs衰老进程,为MSCs 更好的用于生物治疗和组织再生提供可能。