无菌动物在肠道微生物组研究中的应用与发展

胡雅谦,王珊珊,张童,袁嘉丽∗,牛海涛∗

(1.云南中医药大学基础医学院,云南省中医药学分子生物学重点实验室,昆明 650500;2.病毒致病及防控教育部重点实验室(暨南大学),广州 510632;3.暨南大学基础医学与公共卫生学院/暨南大学实验动物管理中心/广州市无菌动物与微生态转化重点实验室,广州 510632)

人体肠道中的菌群数量多且结构复杂,它们寄生在宿主的肠道内,参与宿主发挥多种生理生化功能的过程。肠道不仅是人体消化吸收的重要场所,因为肠道菌群的存在,也成为了最大的免疫器官,在维持人体正常免疫防御功能中发挥着极其重要的作用[1]。肠道细菌与人类宿主存在共生关系并共同进化,主要是免疫遗传和环境因素影响组成。肠道菌群定植取决于包括年龄、分娩方式、母亲的菌群组成、早期使用抗生素和喂养方案在内的多个因素,组成主要受免疫遗传和环境因素的影响。人体的微生物群由1×1014多种微生物组成,分布在人体的不同部位,是人体最大的微生物群[2]。

随着生命科学与技术的发展,真实性和精确度对于实验研究、鉴定和测试结果的要求越来越高,实验结果必须准确,可循环重复,同时具有可比性,对标准实验动物的合理选用和运用是实现此目标的先决条件和保证。从微生物学的观点看,普通实验动物都会携带着细菌和病毒,尤其是在有关于微生物组的研究中,用普通动物进行医学研究,会被各种因素影响,从而产生误差。使用无菌动物作实验就可以弥补普通动物实验中的一些不足。在研究肠道微生物组的过程中,选择合适的实验动物尤为重要,无菌动物的出现解决了许多现代医学研究的难题,为现代医学研究提供了新的思路。

1 对无菌动物的认识和发展

根据微生物的控制水平,可以把实验动物分成四个类别,即无菌动物(germ free,GF);悉生动物或已知菌动物(gnotobiotics);无特定病原体动物(specific pathogen free,SPF);普通动物(conventional)[3]。其中,无菌动物是一种在机体的任何部分以及其生活环境中都没有发现活的细菌、真菌、病毒和寄生虫的动物,由剖腹产和胚胎移植而来,人工饲养并在无菌隔离室内维持[4]。严格意义上来说,所谓“无菌”就是在一定时期内,按照现有的科学知识和检测手段,无法检测到已知的细菌和寄生虫。

1.1 无菌动物的发展

无菌动物的出现和发展起始于十九世纪后期,确立了动物体内没有微生物也能生存的概念[5]。最先培育成功的无菌动物是豚鼠,并于1959 年由Teah 成功繁殖[6],第1 个无菌大白鼠群也是由Pollard等[7]所在的实验室建立,并于1963 年发表无菌大鼠肿瘤研究的相关文章。

随着无菌动物的出现及趋于成熟的养殖,在20世纪中后期出现了系统性关于的无菌动物的研究。早在1948 年,Reyniers等[8]研究了无菌矮脚鸡完整的生命周期。关于无菌动物的研究发现其盲肠增大,原因可能是尿素在肠道内的积累[9-10]。对肠道微生物代谢产物的研究,从1962 年就开始了[11]。二十世纪五六十年代主要是着重于关于无菌动物本身的研究,例如无菌动物产生的肺炎及肺部病变的研究[12-13];关于无菌大鼠牙结石的相关研究[14],无菌动物的对病毒的反应及其他免疫反应[15-16],1964 年Gibbons等[17]尝试在无菌小鼠中建立人源化菌群。在1976 年和1979 年就已经有人用无菌大鼠造模进行结肠癌变和急性肝昏迷相关的实验研究[18-19]。

1.2 无菌动物的生理特征

无菌动物因为体内不存在可以检测到的细菌,所以其生理结构与普通实验动物存在区别。无菌动物的培养发展到现在,无菌动物在外形上与普通动物一般无二,但在结构和功能上存在较大的区别。无菌小鼠和SPF 小鼠在解剖和生理上存在差异,无菌小鼠的盲肠扩大了4～ 8 倍。无菌成年啮齿类动物的体重低于SPF 级啮齿类动物,小肠较SPF 级啮齿类动物更不发达、表面积更小、蠕动速度更慢。无菌动物绒毛不规则,上皮细胞更新减少[20]。因此,无菌动物利用营养的能力更差。无菌小鼠胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)表达的增加导致无菌小鼠比正常小鼠的脂肪更少、更薄,因为从饮食中提取能源效率较低[21]。除此之外,无菌动物改变了免疫系统,比SPF 动物更容易感染[22]。

关于无菌动物本身属性的研究使人们对无菌动物机体构造和功能的了解增多,这使得无菌动物更加频繁地出现在科学研究之中,尤其是关于生物学和医学的研究[23]。近年来,肠道微生态在对于人类健康状态和疾病发生发展的影响受到了广泛关注,鉴于无菌动物无菌的特点,使其成为研究菌群非常有效的工具,因此无菌动物应用在肠道微生物组的研究也越来越常见。

2 无菌小鼠应用于相关疾病肠道微生物区系的研究

现代实验研究中小鼠已经成为最常见、使用最多的实验动物,小鼠具有较强的繁殖能力、体积小、易操作等优点,更主要的是因为小鼠的基因与人类有许多相似之处[24],从十七世纪开始,小鼠就被用来作为实验对象,随着科技的进步和时代的发展,如今用于科学研究的动物已经更加规范和系统化,实验小鼠已经相对成熟,基因更加纯正,个体差异小,目前已成为是使用最广泛、研究最详尽的哺乳动物实验动物。

近年来越来越多关于肠道微生物组的研究发现,肠道微生物区系的改变以及肠道微生态的平衡与各种疾病的发生及人类系统和器官的发育都有一定的关系,无菌小鼠广泛应用于消化、免疫、代谢、神经系统及其他相关系统疾病的实验研究,是宿主-微生物相互作用研究的宝贵实验工具。

2.1 消化系统疾病

近年来,恶性肿瘤的发病率和死亡率逐渐攀升,其中中国的癌症死亡病例占全球的1/3,已成为最主要的死亡原因之一[25]。恶性肿瘤能够尽早发现,尽早诊断,尽早治疗对该类疾病的治疗和预后都有极大的帮助,肠道菌群作为一个非传统指标,如果能在该类重大性疾病发展过程中成为诊断指标,就有可能对恶性肿瘤疾病进行一定的控制。

研究表明,肠道微生物群通过微生物及其代谢产物参与结直肠癌的发病。Coker等[26]研究整合了结直肠癌和结直肠腺瘤患者的肠道代谢微生物群,并将其与健康受试者进行了比较,代谢物途径富集和整合分析表明,肠道代谢物及其与肠道微生物群的关系在结直肠癌发生过程中受到干扰,粪便代谢物除可用于细菌外,还可用于结直肠癌和结直肠腺瘤的非侵入性诊断。肠道菌群在结直肠癌发病具有一定的作用,Wong等[27]使用结直肠癌患者粪便标本对无菌小鼠和常规小鼠进行粪菌移植,该研究结果显示,来自结直肠癌患者的粪便微生物群可以促进无菌小鼠和给予致癌物的小鼠的肿瘤形成。在该实验研究中,研究人员设置常规抗生素清菌小鼠组与无菌小鼠组,两组进行对比,使实验结论更具有说服力。抗生素无法清除所有的微生物,仍会有菌群的残留,所以同时使用无菌小鼠,可以判断实验结果是否会受到残留菌群的干扰。

肠道菌群一旦被证明可能成为参与重大疾病病程发生发展中的角色,那么在疾病早期的诊断具有重要意义。肠道菌群的动态是可以人为调整的,因此也为临床治疗提供了不同的方向。

2.2 免疫系统疾病

肠道菌群与宿主免疫能力相关也是近几年研究的热点。胃肠道拥有体内最大的巨噬细胞隔间,充当宿主防御和免疫的媒介。最新研究数据表明,肠道巨噬细胞的功能多样性超出了经典免疫的范围[28]。

免疫系统的正常发育成熟离不开肠道微生物群的参与,其中肠道相关淋巴组织的发育在肠道黏膜自身抗原的耐受性诱导中发挥重要作用。Brown等[29]对无菌小鼠的研究表明,这些GF 小鼠显示CD4+T 细胞数量以及分泌IgA 浆细胞和抗菌肽减少。GF 小鼠的脾和淋巴结发育异常,B 淋巴细胞及T 淋巴细胞在生发中心及滤泡旁的数目分别减少。早在人类胚胎时期,人体肠道免疫系统就已经开始成熟[30]。

肠道菌群除了对免疫系统的影响,有越来越多的研究证明,肠道菌群的改变在自身免疫性疾病的发病机制中也有一定的作用。许多自身免疫性疾病的患者,例如乳糜泻、多发性硬化症、类风湿性关节炎、干燥综合征和Ⅰ型糖尿病,都会出现肠道菌群结构和功能的改变[31]。人体的免疫是一个复杂的过程,免疫系统为身体提供了一层保护,可以抵抗外来的致病菌,但是当免疫系统开始攻击自身的物质,破坏自身的组织时,就会导致自身免疫病的发生。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节慢性炎症、骨侵蚀和软骨破坏为特征的全身性自身免疫性疾病。RA 的致病机理尚不明确,但已有大量的研究表明,肠道微生物参与了RA 的发病和发展[32]。Ferro等[33]研究发现,RA 患者肠道菌群的组成和功能发生改变,与健康对照组相比,肠道内微生物的多样性明显下降。此外,RA 病人肠道菌群的多样性随病程延长而下降。与常规定植小鼠相比,无菌小鼠不仅类风湿性关节炎患病率高,无菌小鼠的系统和肠道T-helper 17 细胞分化均显著降低,这表明免疫耐受与微生物组密切相关。此外,在关节炎发病前针对肠道屏障功能障碍可减少胶原蛋白诱导关节炎的发展[34]。

除了RA,其他自身免疫性疾病也被证实会出现肠道菌群的紊乱,甚至会出现明显的某单种菌的富集或减少,也有某种肠菌代谢物的特异显著性变化,这对于疾病发生发展的研究是重要的发现,而这些研究结果往往离不开无菌动物的验证,经过反复的临床前研究,肠道菌群有望成为自身免疫性疾病的诊断和治疗方向。

2.3 内分泌系统疾病

内分泌系统疾病及其并发症在现代生活中已经成为困扰人类健康的一类常见慢性疾病。Li等[35]发现一种新型肽,可以口服治疗肥胖症,在寻找该药物的作用机制时,使用无菌动物证明了该药物减少肥胖部分独立于肠道微生物组,利用SPF 级别的小鼠与GM 小鼠的实验对比发现了该新型肽通过改善黏液层厚度的降低来缓解肥胖症的机制主要是因为其可以导致A.musinifhila的定植。A.musinifhila是一种从人类粪便中分离出来的椭圆形革兰氏阴性细菌,在过去十年中,越来越多的研究证明,在糖尿病、心血管疾病、疾病性肠病、神经疾病、肝疾病中都发现与A.muciniphila密切相关[36-40]。在关于菌群的研究中,无菌动物的应用确实使微生物区系的研究更加的清晰和准确,它能更好的控制变量,完全排除除目的菌以外其他菌种对实验结果的干扰,也能更清晰地明确致病菌的种类。

糖尿病也是现代常见的一类内分泌系统代谢疾病,长期高血糖会导致各种组织,特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。Pan等[41]发现将健康供体的盲肠微生物群转移可以恢复肠道微生物群和基线免疫参数,从而缓解抗生素诱导的Ⅰ型糖尿病发展,并且使用无菌小鼠进一步证明盲肠微生物群的保护作用可以传递给下一代,但是微生物组丰富度和均匀度降低。代谢类疾病往往是一种长期、慢性发展的疾病,慢性疾病越早诊断预后越好,肠道菌群及其代谢物已被证实在这个过程中发挥了一定的作用,肠道微生态不仅是作为疾病发展和机制的研究,更有成为疾病早期诊疗的潜力,而将肠道微生态从基础研究发展到可以安全有效的应用于临床,实现其功能化,无菌动物将是关键工具。

2.4 神经系统疾病

随着社会经济的发展,人们生活压力的增大,精神抑郁方面的疾病逐渐成为危害人们生命健康不容忽视的一部分。重度抑郁障碍(major depressive disorder,MDD)是基因和环境相互作用的结果。根据世界卫生组织的数据,MDD 是全球残疾的主要原因之一[42]。

肠道微生物群可以通过微生物区系-肠道-脑轴对大脑产生作用,从而对神经系统疾病的发生发展有一定的影响。肠-脑轴参与多种生理过程,包括饱腹感、食物摄取、调节葡萄糖和脂肪代谢、胰岛素分泌和敏感性以及骨代谢[43]。Zheng等[44]研究表明与传统饲养的健康对照组小鼠相比,小鼠肠道微生物区系的缺乏导致了强迫游泳实验中不动时间的减少,比较了MDD 患者和健康对照组的肠道微生物组成,两者之间存在显著差异,于是将来自MDD 患者的抑郁微生物群移植到GF 小鼠身上,与移植来自健康对照个体的健康微生物群相比,结果是出现了类似抑郁的行为。最近研究发现肠-脑轴在能量和葡萄糖代谢中有重要作用,在用餐期间,肠道为大脑提供关于进入的营养物质的重要信息[45]。这种肠脑通讯受到从肠道分泌的肽或激素的调节,这些信号分子可以进入循环并直接作用于大脑,或者它们可以通过旁分泌作用间接作用于支配肠道的局部迷走神经和脊髓传入神经元。肠道菌群及其代谢物已经成为了将神经系统与循环系统联系起来的关键因素。

2.5 其他系统疾病

现有研究表明肠道菌群会参与许多疾病的发生发展,是解开某些疾病发病机制的关键所在。而无菌动物也被广泛应用于这些疾病的研究之中。

肺癌是呼吸系统严重的疾病,发生发展与慢性炎症密切相关,但炎症的原因和特异性免疫介质尚未完全阐明。肺是一种粘膜组织,被不同细菌群落定植,所以肺部的病变与局部微生物有着紧密的关系[46]。

Jin等[47]研究表明局部微生物区系通过激活驻留在肺内的γδT 细胞来引发与肺腺癌相关的炎症。无菌或经抗生素处理的小鼠可显著避免因kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kirsten rats arcomaviral oncogene homolog,Kras)突变和肿瘤抑制蛋白P53丢失而导致的肺癌发展。该研究中,为了排除微生物区系的影响,使用了无菌动物,而无菌动物也在其机制研究中扮演了重要角色。

心血管疾病与肠道微生物也存在一定的联系,肠道细菌群可引起内脏血流动力学和组织学改变,与门静脉高压症相关,肠道抗菌肽血管生成素4 的表达在GF 小鼠中受到抑制[48]。此外,微生物区系与动脉粥样硬化的发展有关,Kiouptsi等[49]研究发现GF Ldlr-/-小鼠主动脉根部斑块中的平滑肌细胞数量减少。另外,Edwards等[50]的研究发现在无菌条件下饲养的雄性和雌性无菌小鼠表现出阻力动脉收缩的减少,这些变化在无菌雄性小鼠中比在无菌雌性小鼠中更明显。

肠道微生物区系对骨骼肌质量和功能也存在一定的影响。Lahiri等[51]将缺乏肠道微生物区系的无菌小鼠的骨骼肌与具有肠道微生物区系的无病原体小鼠的骨骼肌进行了比较。与无病原体的小鼠骨骼肌相比,无菌小鼠骨骼肌出现萎缩,胰岛素样生长因子1 的表达减少,与骨骼肌生长和线粒体功能相关的基因转录减少。对无菌小鼠的骨骼肌、肝和血清进行的核磁共振光谱分析显示,与无病原体小鼠相比,包括甘氨酸和丙氨酸在内的氨基酸的数量发生了多种变化,无菌小鼠的血清胆碱也降低了,肠道微生物区系在调节小鼠骨骼肌质量和功能方面发挥了作用。

大量的研究表明人体各个系统出现功能结构改变时,往往伴随着肠道微生态的变化,肠道微生物群的复杂关系可能是将人体各个系统联系起来的重要途径,临床已经有了经粪菌移植治疗疾病的先例,这说明肠道菌群是具有临床潜力的,而从庞大的肠道微生物区系中筛选出作用于各个复杂联系的目标菌种实现应用,无菌动物是目前最好技术工具。

3 其他无菌动物在肠道微生物组研究中的应用

随着科学技术的发展,实验研究的规范化,越来越多的不同种类的动物被用于实验研究,这也丰富了无菌动物的种类,除此之外,人源化菌群动物也被广泛应用于现代实验研究中。

3.1 不同种类的无菌动物应用于肠道微生物组研究

传统的实验动物绝大多数是脊椎动物门的哺乳纲动物,较常用的有小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猪、猴等,关于无菌动物的研究,最初研究成功并能进行繁殖的无菌动物是豚鼠。然而无菌动物发展到现在,种类已经逐渐增多。

传统啮齿类动物已广泛应用于实验研究。而无菌小鼠与普通抗生素处理的小鼠相比,在肠道微生物组研究中具有明显优势。Lundberg等[52]进行的抗生素处理与无菌啮齿动物的微生物群移植研究显示,在隔离器中维持的无菌动物仍然是长期微生物移植的最佳对照模型。

除了最常见的鼠模型以外,还出现了无菌兔的实验动物模型。Shanmugam等[53]建立了无菌兔的阑尾模型,以诱导炎症反应的特定细菌的变化,该研究发现特定的微生物组成可以诱导炎症,得出了该模型可能有助于研究特定细菌在肠道建立炎症反应的机制。

除此之外,与常用的实验室啮齿动物相比,猪在解剖学、生理学和遗传学上与人类更接近[54]。早产儿出生时的器官系统发育都不完善,会导致其免疫功能低下,免疫系统不发达和微生物区系不平衡的早产儿有非常高的生物失调风险,往往先于坏死性小肠结肠炎,使用动物模型可以帮助调查和了解不同条件对这些免疫功能低下婴儿健康的影响。Splichalova等[55]建立了早产无菌仔猪对早产的相关研究,该研究发现早产无菌仔猪的肠道在无菌条件下表现出轻微的炎症。该模型建立了早产、子宫切除衍生的无菌仔猪,在没有保护性母体免疫球蛋白的情况下,可以用于研究微生物区系、营养和治疗干预对脆弱免疫缺陷早产儿发育和健康的影响。肠道微生物在胎儿的时候就已经参与胚胎发育,Hiltunen等[56]研究表明,将早产儿胎粪微生物移植到无菌小鼠中,可诱导无菌小鼠出现生长衰竭、炎症激活和代谢紊乱。这佐证了出生后生长受限、代谢紊乱和炎症反应过度可能都与肠道微生物失调相关。

斑马鱼与人类基因组高度相似(70%),对污染物敏感,另外,由于其易于处理胚胎和幼虫在GF 和相关模型中的表达,转基因的斑马鱼的模型较易建造且种类多[57]。Deng等[58]在关于鼠李糖乳杆菌的研究中,使用了无菌斑马鱼。该研究的目的在于探究鼠李糖乳杆菌野生型菌株与其突变株在无菌斑马鱼生物膜形成过程中的差异,以及对产肠毒素大肠杆菌引起的炎症反应的抵抗能力。这项研究为益生菌通过控制细菌群体感应系统对动物肠道健康进行靶向调控提供了思路。Rea等[59]在肠源性代谢物影响神经发育基因表达相关研究中也使用了无菌斑马鱼模型,观察了无菌条件下斑马鱼胚胎对早期神经发育的影响,以及研究是否可以通过治疗来自斑马鱼肠道微生物群的代谢物来拯救任何潜在的变化。不同种类的动物与人类各个方面的相似度不同,无菌动物的多元化发展是必要的,以便于实现比较医学的精准,为以后更好地应用于临床奠定基础。

3.2 基于无菌动物的实验动物的应用

无菌动物在一定程度上确实很好的控制住了关于微生物区系的变量,但是在实际的研究当中,不得不根据实验的实际情况对无菌动物进行一定的处理,使其更好的满足不同实验的要求。当宏基因组学和其他的一些组学交叉的时候,将成熟的疾病模型无菌化或者将无菌动物进行预处理,成为更理想的实验动物模型也是无菌动物现代发展的显著进步。

非肥胖糖尿病(non obese diabetes,NOD)小鼠模型是一种较为成熟的Ⅰ型糖尿病模型。Neuman等[60]将人肠道菌群转移到无菌NOD 小鼠,发现在NOD 模型中,无论供者的表型如何,任何转移的微生物群都可以降低糖尿病的发病率,与无菌NOD 小鼠相比,所有菌群人源化的NOD 小鼠的糖尿病的发生均有明显的延迟。该实验证明了肠道菌群对Ⅰ型糖尿病发病有延迟作用,间接说明肠道菌群参与了Ⅰ型糖尿病的发生发展,这对以后关于研究肠道菌群在糖尿病发病机制研究的实验设计中具有一定的参考意义。

Mottis等[61]关于四环素诱导的有丝分裂刺激介导对流感的疾病耐受性的研究中,在细胞和无菌小鼠模型中证明,四环素类药物诱导轻度适应性线粒体应激反应,该实验中使用无菌C57BL/6J 小鼠,在实验前先给予多西环素,消除了其对微生物群的潜在混杂影响,从而对比发现先导化合物9-叔丁基氧环素对肠道微生物群没有影响。在这项研究中可以发现尽管使用了无菌小鼠,但是在研究对微生物区系有直接影响的药物时,为了排除此类直接影响,也可以对无菌动物进行抗生素处理,使实验数据更具有可信度。

随着基因技术的发展,基因工程改造的无菌鼠也广泛应用于微生物组的研究中,特别是有关于微生物组和基因组的交叉研究。内质网到细胞核信号2(Endoplasmic Reticulum To Nucleus Signaling 2,ERN2)是微生物群诱导的杯状细胞成熟和结肠粘液屏障组成所必需的,Grey等[62]在该研究过程中,使用了无菌ERN2-/-的小鼠,发现肠道菌群的定植诱导了ERN2 的表达,而缺乏ERN2 的小鼠的非生物微生物群落转移到无细菌的野生型小鼠中,实验结果发现并不能诱导杯状细胞的发育,也无法增加对结肠炎的易感性。这说明ERN2 参与粘膜表面进化,并介导肠道微生物和结肠上皮之间的联系,是维持正常内稳态所必需的。Tlaskalová-Hogenová等[63]研究表明,与传统饲养的动物相比,以标准低胆固醇饮食喂养的无菌载脂蛋白E 缺乏小鼠,其动脉粥样硬化的发展速度更快。运用现有的技术将无菌动物进行人为改造,也丰富了无菌动物的类别,实现了无菌动物的多样化。

4 讨论与展望

微生物组被称为人类第二基因组。无菌动物是研究微生物组的核心技术工具,但无菌动物作为一种研究工具参与微生物组的相关研究,还需要一定的发展,建立规模化的无菌动物体系。可以通过粪菌移植得到需要的悉生动物,将人源化菌群动物用于研究,实现比较医学的精确性;无菌动物存在免疫系统的缺陷[64],研究人员可以根据自己研究的需要,对无菌动物进行不同的抗原刺激,得到更好、更适合自己研究的无菌动物。此外发展基因工程动物和无菌动物的整合体系,把基因工程动物转化为无菌动物,便于研究基因和微生物的相互作用关系。

我国之前的实验动物存在种类少、级别低、质量差[65]的缺点,随着比较医学学科的发展,现在比较医学数据大平台的建立也在进行中,该平台系统梳理了实验动物、动物模型和动物实验数据,形成多维度跨时空数据比较分析结果[66]。无菌动物是比较医学的一个新兴工具,需要规模化和标准化,无菌动物的多样化发展也是必然趋势,对无菌动物的使用不能只停留在证实微生物组与表型的因果关系上,它不仅是一个因果和机制研究的工具,更重要的它有可能发展为应用研发过程当中的筛选工具和评价工具。