基于APP／PS1 双转基因小鼠与野生型小鼠比较综述学习记忆相关行为学实验优缺点和注意事项

尚培骏姬乃春杨锦雯赵沅杰拓振杰张晓华

（1. 西安医学院公共卫生学院，西安 710021；2. 陕西省脑疾病防治重点实验室／西安医学院运动健康研究中心，西安 710021；3. 厦门大学神经科学研究所／福建省神经退行性疾病及衰老研究重点实验室，福建 厦门 361005）

动物行为学实验为研究大脑认知功能、情绪功能和相关病理生理学提供重要依据，现已成为神经病理学理论重要支撑之一［1］。 不同于人类的认知功能可通过读写等直观方式反映，动物的认知功能需要通过测量其学习记忆等方面体现进行评价［2］。在众多实验动物中，小鼠等啮齿类动物因其喜欢探索陌生事物和环境的天性［3］，成为典型动物行为学模型之一。 在行为学实验过程中，实验者可借助实验器材创造多种合适的刺激点与刺激条件，以便更好地观测小鼠运动能力、探索行为、学习记忆行为等，进而帮助研究基因工程小鼠的学习记忆能力、观察小鼠的用药反应情况、评价药物的安全性和可靠性，为研究疾病发病机制等提供重要依据。 目前，学习记忆相关行为已被认为是探索人类神经系统疾病最简单、直接且安全的研究方法［4］。 随着记忆学研究的快速发展，学习记忆理论不断涌现，实验动物模型发展道路也在不断向前，各类型记忆被不断地发现、定义，为神经生理学和心理学提供研究基础［5］。 目前主要的学习记忆相关行为学方法包括各种迷宫、旷场实验、新物体识别实验、情景恐惧实验、转棒疲劳实验等。 但究竟在何种情况下采用何种实验方法没有精确地划分。

《柳叶刀》2020 年发布的一项报告显示，全球约有5000 万人患有痴呆症，预计这一数字到2050 年将增加到1.52 亿［6］。 目前65 岁以上老年人患有阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的比例约占11%，85 岁以上的老年人患病比例更是高达42%。APP／PS1 双转基因小鼠是AD 主要的动物模型之一，该小鼠表达突变的人类早老素（Presenilin1，PS1） （DeltaE9） 和人鼠淀粉样前蛋白融合体（APPswe）［7］，这两个基因的表达都由小鼠朊病毒蛋白启动子启动［8］。APP基因是AD 病理症状之一老年斑成分人淀粉样蛋白β（Amyloid β，Aβ）的前体蛋白。 人类早老素基因DeltaE9 突变是该基因的第9个外显子缺失产生的［9］，此突变会导致早发性老年痴呆症［10］。 因此，为了探索学习记忆相关行为学的特点，本研究通过分析对比APP／PS1 小鼠和野生型小鼠在不同行为学实验中的运动能力、新物体识别能力以及学习与记忆能力的表现，综合各实验的优缺点和评价指标，阐述各种行为学实验的特点和应用特点，为研究者采取合理的行为学实验方法提供更好的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级C57BL／6J 背景的APP／PS1 双转基因健康小鼠和野生型C57BL／6J 雄性健康小鼠，3 月龄各60 只、6 月龄各95 只；3 月龄体重22.7 ～25.2 g；6月龄体重29.5 ～34.5 g，购于北京华阜康生物科技有限公司【SCXK（京）2019－0008】，饲养于西安医学院实验动物中心【SYXK（陕）2022－04】，环境温度维持（23 ± 1）℃，12 h 光照循环。 除T 迷宫实验期间进行饥饿处理外，小鼠其余时间均自由采食、饮水。动物行为学实验全程在西安医学院SPF 级动物行为室进行，遵循实验动物福利伦理审查指南【GB／T35892－2018】，经西安医学院动物伦理委员会审批（XYLS 2019016）。

1.1.2 主要试剂与仪器

APP、PS1 引物 （ 金斯瑞， RP10004CN、RP10009CN），50 × TAE（生工，B548101），琼脂糖（吉至，9012-36-6），DNA ladder 核酸燃料（碧云天，D0139），4 × Taq Master Mix，8 × DNA 缓冲液（碧云天， D0072）， DL2000 DNA marker （ 赛默飞，SM1391），新洁尔灭（利尔康，30701122），75%乙醇（利尔康，ri5FTXeVtZj5），蒸馏水。 T 迷宫（Noldus，T-Maze）、Y 迷宫（Noldus，Y maze）、新物体识别探索箱（ Noldus， PhenoTyper ）、 旷场箱 （ Noldus，PhenoTyper）、疲劳转棒仪（众实科技，ZB ～200），动物运动轨迹跟踪系统（Noldus EthoVision XT）、小动物行为学视频记录与分析系统（Panlab SMART 3.0），摄像头（SONY，FCB-EW9500H）。

1.2 方法

1.2.1 Y 迷宫

Y 迷宫是基于啮齿动物对新环境的自发探索能力而设计的实验装置，由三个完全相同的臂组成、三个臂之间为120°夹角，呈Y 字形分布（如图1）。小鼠在前一次的记忆基础上做出下一次进臂选择，令其不断进出各个臂［11］，是测量动物学习记忆能力的典型方法。 根据分析小鼠探索进入各臂的次数、顺序进而反映实验动物的瞬时记忆能力（instantaneous memory）［12］。 相比于其他实验方法，Y 迷宫更加偏向于工作记忆，在加工存储短时间内记忆的能力有更为直观地表现［13］，较为简便且无需动物学习任何规则来进行趋利避害［14］，有一定的实用性。

图1 Y 迷宫示意图Figure 1 Schematic diagram of Y maze

实验选用3 月龄、6 月龄的AD 小鼠与WT 小鼠各20 只进行实验，实验开始随机选取一臂为起始臂并将小鼠放置于起始臂末，让小鼠进行自由探索8 min， 记录小鼠运动轨迹与进臂次数N，记录小鼠运动轨迹的自主交替进臂数（alternation，如ABC）：计算自主交替率，即alternations／（N-2）、在探索结束一臂后返回上一探索臂的自主返回数（return，如ABA）以及在两次连续探索同一臂的自主重复数（repeated）的自主返回率和自主重复率［15］。

注意事项：（1）Y 迷宫三臂内部各有不同标记，协助小鼠分辨三臂。 （2）每组小鼠随机从不同的起始臂进入，每只小鼠实验完成后需用乙醇、新洁尔灭、蒸馏水依次擦拭迷宫，消除因上一只小鼠气味遗留造成的影响。 （3）实验期间实验人员切勿随意走动，切勿移动实验设备或发出噪音。 （4）小鼠行为学实验期间，应保持室内环境接近饲养环境温度，过高或过低会导致小鼠产生烦躁或战栗，使其拒绝探索。 （5）以小鼠尾根进入虚线位置（见图1虚线）为进臂标准。

1.2.2 T 迷宫

T 迷宫由一起始臂以及两对称的目标臂构成，起始臂（start arm）和目标臂（goal arm）夹角90°。 相较于其他实验，T 迷宫利用动物觅食行为和对周围环境探索的习性［16］，在测定动物学习与记忆能力中的长时记忆方面拥有更高的准确性［17］。 实验以小鼠是否选择正确目标臂为标准，对小鼠的学习和记忆能力进行评判［18］。 T 迷宫通常用来研究动物的空间工作记忆（spatial working memory），即测定动物在一定规则下对有用的信息的记忆存储及提取。经改进后的T 迷宫实验方法也可用来评价参考记忆（reference memory），即小鼠自己与记忆产生联系后，探究小鼠行为与记忆之间的相互影响［19］。 常见的T 迷宫有诱导探索型实验（Ⅰ型T 迷宫）与惩罚型实验（Ⅱ型T 迷宫）两种。

Ⅰ型T 迷宫，通过借助食饵，诱导小鼠探索迷宫［20］。 诱导探索阶段，在迷宫各臂放置2 ～3 个食饵，诱导小鼠探索迷宫3 min，适应3 d。 待小鼠完全适应迷宫之后，在两目标臂末端放置食饵后随机关闭一臂（如图2 单虚线）。 实验选用6 月龄AD 小鼠和WT 小鼠各10 只进行实验，实验开始将小鼠放于起始臂末端开始计时，让小鼠自由觅食，直至小鼠接触食饵，停止计时，此段时间记为训练时间；待小鼠离开食饵区域，将小鼠带离迷宫，一段时间后（适应阶段间隔5 s，实验阶段第1 次间隔20 s、第2 次间隔1 min 重复实验）将小鼠重新放回起始臂，打开封闭臂闸门，让小鼠自由探索，在新的、有食饵的臂（即原封闭臂）和旧的、无食饵的臂进行选择，以第1 次进入目标臂为评判标准，若进入原封闭臂记得分为1，反之为0；在接触食饵后停止计时，记为记忆时间。 1 h 后再测试一轮［21］。

图2 T 迷宫示意图Figure 2 Schematic diagram of T maze

Ⅱ型T 迷宫实验存在特殊的惩罚机制。 实验适应阶段，让小鼠在T 迷宫内自由探索3 d，每天3 min。 在小鼠熟悉迷宫之后，第4 天让每只小鼠自主探索T 迷宫3 ～5 次，记录进入次数多的一侧，并记为偏好臂［22］。 选用6 月龄AD 小鼠和WT 小鼠各15 只进行实验，实验开始，将各小鼠对应偏好臂闸门关闭，迷宫另一臂末端放置食饵。 第一步将小鼠放于起始臂末端让小鼠自由探索且开始计时，直至小鼠接触食饵［23］，停止计时并记此段时间为学习时间；间隔10 s 后，将小鼠重新放回起始臂末端，打开偏好臂闸门并开始计时，若小鼠进入非偏好臂（放置食饵的臂）则计得分为1，若小鼠进入偏好臂，计得分为0，并且关闭偏好臂闸门惩罚小鼠，10 s 后打开闸门并继续记录进入非偏好臂次数，直至再次触碰非偏好臂食饵［24］停止计时，记此时间段为记忆时间。

注意事项：（1）诱导时应选择气味较小的食饵，避免小鼠以嗅觉取代记忆引起实验误差。 （2）食饵体积不宜过小，搁置在每臂中央，便于小鼠发现食饵。 （3）Ⅱ型T 迷宫中小鼠3 min 内未探索或Ⅰ型T 迷宫小鼠5 min 内未探索则排除此次实验。 （4）每组实验完成后，待小鼠停止进食后再将小鼠取出，避免小鼠受到惊吓造成后续实验误差，每只小鼠做完一轮实验要采用新洁尔灭、乙醇和水分别擦拭迷宫。 （5）以小鼠尾根部为标准评判是否进臂。

1.2.3 新物体识别

新物体识别实验是基于人类患有失忆症时识别环境的差异而发展起来的，用于评价啮齿动物的新物体识别记忆能力与识物记忆。 本实验基于小鼠在新环境下自由探索的习性和对新物体的好奇心［25］。 该实验无需像迷宫实验，以食物为介控制小鼠，也不需要像转棒疲劳实验一样强制小鼠运动，完全依靠小鼠在密闭空间下的自由探索能力，发现周围环境变化。 在小鼠自由记忆的情况下，更能模拟人类学习、记忆的行为，借此用来评估改善记忆药物的效果［26］。

实验选用3 月龄、6 月龄AD 和WT 小鼠各25只进行实验，实验分为适应阶段和测试阶段。 在适应阶段之前，需进行3 d 的熟悉过程。 实验人员每天将小鼠放到手上抚触5 min，借此消除小鼠紧张恐惧感，并熟悉实验者气味。 实验开始前，剔除活动异常小鼠（活动过少、活动过多、转圈等），符合标准的小鼠在无物体箱体中每天自由探索3 min，待3 d后小鼠熟悉实验箱体内环境［27］，正式开始实验，实验步骤如下。 实验开始：T1 阶段，分别在箱体底板对角放置两完全相同的物体A、B，将小鼠放入密闭环境的箱体中，让小鼠在A、B 两物体周围探索时间累计25 s（以鼻尖凑近物体约2 ～3 cm 为标准），或3 min 内探索时间还不到25 s 则停止探索，将小鼠放回饲养笼，停止T1 阶段。 1 h、24 h 后分别开始短期、长期T2 阶段测试，将其中一个物体换成新的物体b，物体放置位置不变，再次将小鼠放入箱体进行探索，当小鼠在A、b 两物体周围探索时间累计15 s，或5 min 内探索时间还不到15 s 则停止探索，将小鼠放回饲养笼，停止T2 阶段，见图3。

图3 新物体识别实验示意图Figure 3 Schematic diagram of new object recognition test

注意事项：（1）探索物体的时间需要根据小鼠的学习能力摸索，与年龄和基因型密切相关［28］。（2）物体可以选择不同材质、形状和颜色［29］；具有一定重量，防止小鼠推翻；应保证新旧物体存在差异；避免选择太过鲜艳的颜色，如橙色。 （3）每只动物实验完成后需擦拭粪便尿液，因实验在密闭空间内进行，在清洁箱体时切勿用乙醇等刺激性试剂擦拭［30］。 （4）每组实验完毕后，先取出物体，后取出小鼠，减少对动物的刺激。

1.2.4 旷场实验

旷场实验常用于检测啮齿动物运动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度。 自20 世纪40 年代被学者发明以来，旷场实验已经被广泛应用到神经生物学研究与生物节律当中。 旷场实验一方面利用了动物畏惧空旷场地的天性，激发动物趋利避害的内在特点［31］，用来评价小鼠的运动和情绪行为。 另一方面，利用小鼠在好奇心的驱使下探索新环境，旷场也为新物体识别实验的建立提供一定的前提基础［32］。

选用6 月龄AD 小鼠和WT 小鼠各15 只进行实验，实验开始前，实验人员应消除小鼠的恐惧。实验开始将小鼠放入箱体3 min，摄像头记录行动轨迹。 通过软件分析其在中央区与周边区逗留时间、速度和运动距离，以及直立次数和理毛行为等，见图4。

图4 旷场实验示意图Figure 4 Schematic diagram of open-field

1.2.5 转棒疲劳实验

转棒疲劳实验为检测啮齿动物运动功能、抗疲劳能力和昼夜节律提供了方法，主要用于运动协调性、平衡感测试、抗疲劳药物筛选和鉴定，也可间接反映动物的昼夜节律［33］。 实验期间，当动物被放置在滚筒中央的转棒上时，为避免滑落，需调整平衡，随转棒转动而跑动。 通过测量动物在滚筒上行走的时间来评定实验对象的中枢神经系统疾病［34］。

转棒疲劳仪以动物运动时间作为实验指标，若动物掉落，仪器将自动记录动物在转棒上的坚持时间以及滑落瞬间转棒的速度。 因小鼠的协调性由小鼠的中枢神经系统决定，协调性越差的小鼠会在越短时间内从转棒下掉落［35］。 转棒疲劳仪运动能力在帕金森病、酒精依赖、亨廷顿病、智力发育、运动失调和阿尔茨海默病的药物评价等研究上，被认为是非常重要的检测指标［36］。 实验选用3 月龄、6 月龄AD 和WT 小鼠各15 只进行实验，实验适应阶段分为三个阶段，三个阶段间无时间间隙：T1 阶段，转棒以加速度5 r／min2从静止开始匀加速至速度为5 r／min；T2 阶段，更改加速度为10 r／min2，加速至15 r／min 后匀速转动2 min；T3 阶段，继续以加速度10 r／min2加速至20 r／min 后继续匀速2 min。 若小鼠在测试过程中掉落，记录掉落时间［37］，待20 min 后重新对掉落小鼠开始实验，记录小鼠在转棒上持续的时间。 小鼠在进行适应实验期间训练小鼠体力，加强小鼠协调能力。 正式实验阶段，T1、T2、T3 各阶段加速度不变，结束时匀速速度分别达到5 r／min、 15 r／min、18 r／min， 记录小鼠在转棒持续时间。

注意事项：（1）测试期间，舍弃连续3 次以上实验失败的小鼠。 （2）待小鼠稳定站立在转棒上时开始实验。 （3）选择拥有高摩擦系数的转棒材质。

1.2.6APP／PS1 小鼠的培育

实验所用APP／PS1 双转基因小鼠品系为APPswe／PSEN1dE9（C57BL／6J），该小鼠携带小鼠朊病毒蛋白启动子启动下的突变的人早老素基因PSEN1（DeltaE9）和人鼠淀粉样前蛋白（APPswe）融合体，其中PSEN1 的DeltaE9 突变是该基因的第9个外显子缺失产生的，此突变会导致早发性老年痴呆症。 设计了APP和PSEN1 的引物，序列如表1，进行基因鉴定。 该小鼠在大约4 个月皮层开始出现淀粉样斑块，在大约6 个月时海马中出现淀粉样斑块，并且随着年龄的增长而增加大小和数量。

表1 APP／PS1 小鼠引物序列Table 1 APP／PS1 mouse primer sequences

1.2.7APP／PS1 基因鉴定

实验用APP、PS1，两种引物对小鼠的基因型进行鉴定，当小鼠共同表达APP／PS1 基因时，鉴定为APP／PS1 双转基因。 小鼠使用双面耳标进行序列编号，以鼠尾为标本提取DNA。

（1）组织的消化

将Protease Plus 与Buffer L 按1 ∶50 配制，充分混合后向含有样本的EP 管内加入100 μL 新鲜消化液，55℃金属浴／水浴反应30 min（确保鼠尾完全浸入消化液中），后将样本在95℃金属浴／水浴中孵育5 min 以灭活反应蛋白酶。 以12 000 r／min 离心5 min 后取含有DNA 的上清液为PCR 模板。

（2）PCR 的扩增

反应体系在配置过程中，最好处于低温情况下，以确保PCR 扩增的效率以及特异性。 配置比例（见表2）。 将上述配置好的样本进行PCR 扩增，程序为（见图5）：①94℃预变性5 min（1 次循环）；②94℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s（35 次循环）；③72℃充分延伸5 min（1 次循环）；④扩增结束4℃保持。

表2 反应体系的配置Table 2 Configuration of reaction system

图5 PCR 扩增程序Figure 5 PCR amplification procedure

（3）琼脂糖凝胶电泳

在1 × TAE 溶液中加入2%琼脂糖，微波加热充分溶解后，待冷却至50℃时加入核酸染料，充分混匀后倒入模具。 凝固后浸入含有1 × TAE 溶液的电解槽中待用；DNA 扩增产物与DNA 缓冲液混合后以8～10 μL 每孔上样，上样完毕后以120 V 恒压电泳25 min。

以上各种实验方法的设备、评价指标、应用特点的比较见表3，各种行为学实验方法的优缺点比较见表4。

表4 不同行为学实验的优缺点比较Table 4 Comparison of the advantages and disadvantages of different behavior tests

1.3 统计学分析

所有数据均用平均数± 标准误差（±s）表示，数据分析采用SPSS 18.0 软件，数据通过t检验（或mann-whitney 非参数检验），当P＜0.05 为具有显著性差异，作图采用GraphPad Prism 8.0.2 软件。

2 结果

2.1 APP／PS1 小鼠基因鉴定

裂解鼠尾提取DNA，经PCR 和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型，核酸凝胶成像结果显示，GAPDH内参条带在391 bp，APP基因条带在344 bp，PS1 基因条带在608 bp，结果见图6 ～8，可以看到编号为288、289、290、292、293、294、296、297、298、352、353、363、365、366、368、371、373、374、375、376、378 和380 小鼠为APP／PS1 双转基因小鼠，其余为野生型小鼠。

图6 GAPDH 鉴定结果Figure 6 GAPDH identification results

图8 PS1 基因型鉴定结果Figure 8 PS1 genotype identification results

2.2 APP／PS1 和WT 小鼠的工作记忆存在差异且均随月龄增大呈下降趋势

Y 迷宫可以测试小鼠的工作记忆能力。 6 月龄APP／PS1 小鼠相比于WT 小鼠在自主返回率更高，有显著性差异性（P＜0.05，图9），说明同月龄APP／PS1 小鼠工作记忆能力较WT 小鼠差；此外，6 月龄APP／PS1 小鼠的自主交替率较3 月龄小鼠显著降低（P＜0.05，图9），自主返回率频率显著增加（P＜0.001，图9），WT 小鼠的自主交替率频率也随月龄增加而减少，自主重复率频率随月龄增加而增加，但无显著性差异，见图9。 以上结果表明，六月龄APP／PS1 和WT 小鼠工作记忆能力有差异，且APP／PS1 小鼠随月龄增加工作记忆下降更为明显。

图9 3 月龄和6 月龄APP／PS1 小鼠和WT 小鼠Y 迷宫差异比较Figure 9 Comparison of the differences in Y maze of APP／PS1 mice and WT mice at 3 and 6 months of age

2.3 APP／PS1 和WT 小鼠的记忆存储和提取能力具有显著性差异

T 迷宫可以同时测试小鼠的学习和记忆能力，能够反映记忆的存储和提取。 基于Ⅰ型T 迷宫实验，发现6 月龄APP／PS1 小鼠在学习阶段的第1 天记忆时间显著长于WT 小鼠（P＜0.05，图10A）；在测试阶段，第1 天记忆时间显著长于WT 小鼠（P＜0.05，图10D），说明小鼠在第1 次学习和记忆环境下更敏感。 2 d 的测试阶段，APP／PS1 小鼠在得分率方面均显著低于WT 小鼠（P＜0.01，P＜0.05，图10F，10G）。 说明APP／PS1 和WT 小鼠在学习与记忆时间和准确率之间存在差异，APP／PS1 小鼠记忆提取能力显著低于WT 小鼠。 基于Ⅱ型T 迷宫，APP／PS1 和WT 两种小鼠在记忆时间方面未出现显著性差异，但学习方面，APP／PS1 小鼠学习时间长于WT 小鼠（P＜0.001，图10H，10I）；APP／PS1和WT 小鼠在得分率无明显差别，见图10。 综上，APP／PS1 和WT 小鼠在记忆的存储和提取方面存在差异，APP／PS1 小鼠较WT 小鼠记忆存储时间显著增加，记忆提取时间增加，记忆准确率降低。

图10 T 迷宫内学习时间、记忆时间与得分Figure 10 Learning and memory duration and scores in T maze

2.4 APP／PS1 和WT 小鼠的新物体识别能力与识物记忆无明显差异

新物体识别实验可以测试小鼠的识物记忆，结果发现，无论是3 月龄还是6 月龄小鼠，APP／PS1和WT 小鼠对新物体识别记忆均无显著性差异（P＞0.05），见图11。 这与文献报告不同［38］，可能是因为学习阶段时长过短或者学习阶段和测试阶段的时间间隔不同引起的。

图11 3 月龄和6 月龄APP／PS1 和WT 新物体识别实验识别参数Figure 11 Recognition index in the new object recognition test of APP／PS1 and WT mice at 3 and 6 month of age

2.5 APP／PS1 和WT 小鼠的运动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度均存在差异

旷场实验着重于研究小鼠在密闭空间内的运动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度。实验表明：APP／PS1 小鼠的运动能力比同月龄WT小鼠弱，表现在规定时间内的运动距离显著低于WT 小鼠（P＜0.01，图12A）；因两种小鼠移动速度也存在显著性差异（P＜0.01，图12B），所以说明APP／PS1 小鼠活跃性也比同月龄WT 小鼠的低；与WT 小鼠比较，APP／PS1 小鼠进入中心旷场的次数同显著降低（P＜0.01，图12E），且APP／PS1 小鼠待在旷场中央区时间与周围区域时间比显著低于WT 小鼠（P＜0.01，图12K），可得出结论，APP／PS1小鼠对旷场的畏惧程度高于WT 小鼠。 另外，APP／PS1 小鼠的直立次数显著低于WT 小鼠（P＜0.001，图12J），说明APP／PS1 小鼠较WT 小鼠的探索能力更弱，更容易对旷场产生畏惧和焦虑，见图12。 综上所述，APP／PS1 小鼠的的运动能力、探索能力、活跃性较WT 小鼠更差。

图12 6 月龄APP／PPS1 和WT 小鼠在旷场实验的表现Figure 12 Performance of 6-month-old APP／PS1 and WT mice in the open field test

2.6 APP／PS1 和WT 小鼠中枢协调能力无明显差异

转棒疲劳实验主要检测小鼠的中枢协调能力，经实验，并未发现APP／PS1 和WT 小鼠在转棒掉落时间方面的差异，说明中枢协调能力无显著性差异（P＞0.05）， 见图13。 这可能是因为转棒疲劳仪更适用于检测小鼠的与运动协调性相关的神经系统疾病如亨廷顿舞蹈症和帕金森病，在学习与记忆方面仅可能作为辅助或参考指标。

图13 转棒疲劳实验掉落时间Figure 13 Dlatency to fall of rotarod test

3 讨论

动物行为学实验在药理学中已被视为基础实验方法，同时也越来越多的被应用在精神生理学及精神病理学的基础研究中，如在帕金森病症、酒精依赖综合征、亨廷顿病、智力发育、运动失调［39］和阿尔茨海默病的发病机制研究领域发挥重要作用［40］。因此，了解和总结各种行为学实验的特点和适用范围非常关键，能够帮助研究者选择更科学和精准的方法观察小鼠的行为学。 本文作者采用APP／PS1双转基因小鼠与野生型小鼠两种动物，比较验证学习记忆相关行为学实验特点、优缺点、注意事项和应用。 采用Y 迷宫、T 迷宫、新物体识别、旷场实验以及转棒疲劳实验对两种小鼠进行全面的对比分析。 5 种行为学实验各有测试偏重，Y 迷宫测试工作记忆［41］，T 迷宫可以测试学习与记忆能力，特别能够反映记忆的存储和提取，新物体识别测试小鼠的新物体识别能力与识物记忆，旷场测试运动能力、探索能力、活跃性以及对旷场的畏惧程度，转棒疲劳测试中枢协调能力。 经研究发现，雌性小鼠因受雌激素影响，在行为学实验中，经常表现出异常的行为，如潜伏期过长、易焦虑等情况，通常情况下，行为学实验选择雄性小鼠会使实验结果更加稳定［42］。

基于APP／PS1 双转基因小鼠与WT 小鼠实验比较发现，在Y 迷宫中，同月龄的APP／PS1 小鼠与WT 小鼠的工作记忆能力有明显差异，APP／PS1 小鼠较WT 小鼠自主交替率显著降低，以及自主返回率显著增加。 对比不同月龄的同类型小鼠发现，两种小鼠的工作记忆能力均随月龄增加而下降，且APP／PS1 小鼠相比于WT 小鼠下降更明显。 说明APP／PS1 小鼠工作记忆能力显著低于WT 小鼠。在T 迷宫中，APP／PS1 小鼠相比于WT 小鼠的学习记忆能力差，表现为记忆的存储和提取较慢，提取的准确率较差，这与以往的报道是一致的［43］。 在新物体识别实验中，对比两种小鼠的新物体识别能力，通过对比两种小鼠的短时识物记忆和长时识物记忆两个方面，并未发现显著性差异，这与文献报道不一致，这可能与学习和测试阶段的间隔时长存在密切关系［44］，测试和训练阶段间隔24 h，可能两种小鼠的都遗忘了对旧物体的识别记忆。 在旷场实验中，WT 小鼠的运动能力、探索能力和活跃性均显著高于APP／PS1 小鼠，对旷场的畏惧程度和焦虑程度低于APP／PS1 小鼠，也存在显著差异性。 在转棒疲劳实验中，APP／PS1 小鼠与WT 小鼠的中枢协调能力无显著差异性。

现如今，越来越多的动物行为学模型被广泛应用到神经系统疾病和药理学实验中［45］，这些模型都尽可能去贴合小鼠生性习惯，对多种动物的研究和药品应用提供路径。 研究对比了5 种学习记忆相关行为学的特点、优缺点、注意事项和应用，发现Y 迷宫反映小鼠自发的探索行为，是工作记忆的最佳和最便捷的检测方法［46］；T 迷宫对学习记忆的检测更为敏感和细致，能反映记忆的存储和提取；新物体识别实验可能需要更好的摸索学习和测试阶段的时间间隔，并且需要精确的跟踪和识别系统；旷场实验可以作为学习记忆、运动能力、畏惧焦虑行为的综合指标，可以放在一系列行为学实验设计的最开始阶段，便于观察者对动物行为有大致的了解；转棒疲劳实验更适合与运动协调能力相关的神经系统疾病［47］，如帕金森病［48］、亨廷顿病［49］等。 综上，为有关神经系统疾病行为学实验的选择提供了理论基础、方法借鉴和参考标准。