可评价注射式再生支架修复效果的小鼠骨缺损模型的构建研究

王飞燕李志凌尹博丰李佩霖郝瑞聪韩梦月李晓彤田家仪丁丽武文卿朱恒*

（1. 安徽医科大学基础医学院，合肥 230032；2. 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850；3. 空军特色医学中心血液科，北京 100142；4. 军事科学院军事医学研究院实验动物中心，北京 100071）

骨缺损［1］是临床上较为常见的骨损伤类型之一。 严重开放性骨折、高能量创伤、爆炸伤、需要清创处置的骨感染和骨肿瘤切除术等多种场景均会导致骨缺损发生。 虽然骨组织有一定的自我修复能力［2］，但如果缺损组织较多，机体很难完全自我恢复骨的结构与功能［3］。 此外骨缺损区域往往呈不规则状，事先预制的填充材料往往不能完成无缝隙填充，影响了再生修复的效果［4］。

目前骨缺损的主要治疗方法有骨移植［5］、骨组织工程技术［6］、基因治疗［7］等。 骨移植是治疗骨缺损的常用且有效方法之一，其主要包括自体骨移植和异体（异种）骨移植及人工骨修复材料三大类。自体骨来源有限［8］，同种异体骨也具有免疫原性和交叉感染的潜在危险以及伦理学的限制［9］，人工骨修复材料目前仍存在活性不足和骨传导性差等缺点［10］。 在临床迫切需求的驱动下，骨组织工程技术应运而生［11］。 骨再生生物材料是一类组织工程支架［12］，可以支持骨缺损部位的再生过程［13］，同时在原位降解后能够被新生成的骨组织取代［14］。 近年来，水凝胶［15］、纳米纤维支架［16］、3D 打印复合支架［17］等多种形式的骨修复材料已取得重要进展［18］，其中水凝胶显示出与水相似的物理特性，可以模拟人体的组织环境，以最小的侵入方式为缺损部位提供结构支持，使骨缺损通过内在愈合机制进行再生修复，具有独特的优势［19］。

甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）为烯烃双键改性明胶，是一种光敏性的生物水凝胶材料［20］。 GelMA 水凝胶具有优异的生物相容性和细胞反应特性［21］，例如提供合适的细胞粘附位点［22］，因此可以取代人工基底膜或其他天然胶原蛋白水凝胶［23］。 此外，GelMA 水凝胶具有良好的机械性能，用GelMA 构建的3D 微支架可根据需求调整其机械特性［24］。 研究表明，通过可注射GelMA 水凝胶递送的人尿液来源的干细胞外泌体加速骨再生［25］。

小鼠是一种常用的实验动物，便于构建基因动物模型，有利于从分子、细胞和动物等多水平评价再生支架材料［26］。 目前关于小鼠骨缺损模型应用于可注射式再生支架评估的相关研究数量稀少，相关领域工作进展缓慢。 基于此，本研究旨在建立基于可注射式再生支架的小鼠股骨缺损再生修复模型，探究GelMA 对小鼠股骨缺损再生修复的影响，为将来研究可注射式再生支架修复骨缺损提供一种小鼠模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40 只8 周龄健康雌性SPF 级C57BL／6N 小鼠，体重16 ～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2021－0006】。 小鼠饲养于军事医学研究院实验动物中心【SYXK（京）2017－0023】，常规饲料喂养，自由饮食水，日光灯12 h 明暗交替，温度22 ～24℃，相对湿度40% ～55%。 本实验所有操作均经过军事医学研究院实验动物中心实验伦理审批（IACUC-DWZX-2023-505）。

1.1.2 主要试剂与仪器

甲基丙烯酰化明胶（GelMA）（苏州永沁泉智能设备有限公司），型号：EFL-GM-60，组分A：GelMA，白色海绵状，每瓶1 g；组分B：光引发剂LAP，白色粉末状，每瓶0.05 g；4%通用型组织固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司）；兔抗小鼠抗体OCN（23418-1-AP，proteintech）；Masson 三色染色液试剂盒（G1006-20 ML，武汉塞维尔生物科技有限公司）；苏木精-伊红（HE）高清恒染试剂盒（G1076-500 ML，武汉塞维尔生物科技有限公司）；组织RNA 提取试剂盒plus（RN002plus， ES Science）；PCR Pipettes（5-000-1001-x10， Drummond Scientific Company）。紫外光固化电源（苏州永沁泉智能设备有限公司）；双孔恒温水浴锅（LC-WB-2，LICHEN 力辰）；低速台式离心机（湘仪L500）；正置光学显微镜和成像系统均为日本尼康产品。

1.2 方法

1.2.1 可注射式再生支架的制备

（1）光敏性可注射式再生支架原理：甲基丙烯酰化明胶（GelMA）为烯烃双键改性明胶，其可通过紫外光及可见光在光引发剂作用下迅速固化成胶。GelMA 光固化水凝胶兼具天然和合成生物材料的特征，具有适于细胞生长和分化的三维（3D）结构。

（2）光敏性可注射式再生支架配置：首先配制0.25%光引发剂标准溶液，向装有光引发剂LAP（0.25 g）的棕色瓶中加10 mL PBS，40 ～50℃水浴加热15 min，期间振荡数次，使其充分溶解，分装至10 mL 离心管中，每管0.5 mL，再加4.5 mL PBS，配制成终浓度0.25%的标准溶液，该标准液可在4℃避光下保存12 个月。 接着配制15%（w／v）GelMA浓缩溶液，称取0.09 g GelMA，放入避光离心管中，加600 μL 上述光引发剂标准溶液（图1A）；60 ～70℃水浴加热20 ～30 min，期间振荡数次，使其充分溶解；立即用0.22 μm 除菌滤器过滤灭菌，并将其分装后分别稀释为5%、10%、15% 3 个浓度，5%：取50 μL GelMA 浓缩液＋100 μL LAP 标准液；10%：取100 μL GelMA 浓缩液＋50 μL LAP 标准液；15%：取150 μL GelMA 浓缩液。 使用紫外光评估3D 微支架GelMA 的光固化性（图1B），使用PCR Pipettes 移液器评估3D 微支架GelMA 的可注射性（图1C）。

图1 GelMA 水凝胶制备过程Figure 1 GelMA hydrogel preparation process

1.2.2 小鼠股骨缺损动物分组及模型干预

小鼠正常喂养1 周后随机分为4 组：骨缺损组（n＝10），5% GelMA 组（n＝10），10% GelMA 组（n＝10），15% GelMA 组（n＝10）。 用2%戊巴比妥钠（按0.25 ～0.3 mL／100 g）腹腔注射麻醉小鼠，剥离小鼠大腿皮肤、肌肉组织和骨膜，完全暴露股骨外侧面（图2A）；随后，各组操作如下，骨缺损组：使用钻头直径为1 mm 的STRONG90 微型直流高速调速电钻在股骨中、下1／3 交界点制备骨缺损模型［18］，确认深度可达骨髓腔，同时不穿过对侧皮质骨（图2B）；5% GelMA 组：造模方式同骨缺损组，后用PCR Pipettes 移液器向缺损处注射5% GelMA（2 ～3 μL）（图2C）；10% GelMA 组：造模方式同骨缺损组，后用PCR Pipettes 移液器向缺损处注射10% GelMA（2 ～3 μL）；15% GelMA：造模方式同骨缺损组，后用PCR Pipettes 移液器向缺损处注射15%水凝胶（2 ～3 μL）。 每组注射结束后，均立刻用紫外光固化电源在骨缺损位置照射30 s（图2D），最后小心对位缝合肌肉和皮肤，整个过程严密消毒。

图2 小鼠股骨缺损模型建立及GelMA 水凝胶注射过程Figure 2 Establishment of mouse femur bone defect model and GelMA hydrogel injection process

1.2.3 HE 染色

造模2 周后［13］，将小鼠麻醉处死，取造模侧股骨用4%通用型组织固定液固定48 h，10% EDTA 脱钙，石蜡包埋、切片，制备骨缺损区域的5 μm 矢状切片，使用HE 高清恒染试剂盒，将切片置于二甲苯中脱蜡，随后放入苏木素染液0.5 ～1 min；自来水漂洗，1%盐酸乙醇分化3 ～5 s；自来水漂洗，然后1%氨水溶液返蓝1 min；流水冲洗20 s，放入伊红染液中染色15 ～30 s；流水漂洗，依次放入75%乙醇2 min， 85%乙醇2 min，无水乙醇5 min，无水乙醇5 min， 环保型脱蜡透明液透明5 min，最后用中性树胶封片，倒置显微镜下观察骨组织形成情况。

1.2.4 Masson 染色

使用Masson 三色染色液进行Masson 染色。 切片常规脱蜡，用配制好的Weigert 铁苏木素染色5 ～10 min；用酸性乙醇分化液分化，水洗；用Masson 蓝化液返蓝，水洗；丽春红品红染色液染色5 ～ 10 min；以2%冰醋酸水溶液洗1 min；1%磷钼酸水溶液分化3 ～5 min，2%冰醋酸水溶液洗1 min；不经水洗，直接用苯胺蓝水溶液或1%光绿水溶液染1 ～2 min；以0.2%冰醋酸水溶液洗1 min；95%乙醇脱水2 ～3 s，无水乙醇脱水3 次，每次5 s，环保型脱蜡透明液透明3 次，每次1 min，中性树胶封固。

1.2.5 RT-qPCR 分析

取各组小鼠造模侧股骨缺损处组织，放入做好标记的Ep 管内，按照组织RNA 提取试剂盒说明书提取骨组织总RNA。 计算样品总RNA 浓度；根据小鼠OCN、Osterix 序列，使用Premier 5.0 设计合成扩增OCN、Osterix 片段的特异性引物（以GAPDH 基因作为内参），进行引物序列设计（见表1）；根据反转录以及PCR 反应体系，进行RT-qPCR 实验。 为减少误差，各组OCN、Osterix 的表达水平均以相对表达量表示。

表1 各检测基因的引物序列Table 1 Primer sequences of each detected gene

1.2.6 免疫组织化学染色

取材、固定、包埋、切片方法同HE 和Masson 染色，石蜡切片梯度乙醇脱水，用内源性过氧化物酶淬灭、抗原修复并阻断非特异性结合位点后，将股骨切片与OCN 抗体一起孵育过夜，接着滴加与一抗相应种属的二抗孵育1 h，最后DAB 显色，复染细胞核，脱水封片，光学显微镜采图。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 组织学观察

2.1.1 HE 染色

HE 染色观察骨缺损处的组织结构。 术后2周，骨缺损组大部分骨小梁仍处于重塑期，骨小梁排列连续性、致密性较差；10% GelMA 组骨组织结构及骨缺损愈合情况显著优于其他各组。 显微镜下可见较多成熟骨小梁，结构连续，排列整齐、致密；5% GelMA 组和15% GelMA 组，成熟骨小梁数量少于10% GelMA 组，见少量骨组织形成，但骨小梁排列整齐性、连续性、致密性较10% GelMA 组差，如图3。

图3 植入GelMA 后各组小鼠股骨缺损区（HE 染色，n ≥3）Figure 3 Femur defect of mice in each group after GelMA implantation （HE staining，n ≥3）

2.1.2 Masson 染色

Masson 骨胶原染色观察骨缺损处的新骨形成情况。 其结果显示4 组均可见骨缺损部位出现蓝染的新生骨和骨胶原组织，其间夹杂呈点状或条状分布的红染纤维组织。 其中10% GelMA 组的新生骨量面积及胶原、纤维组织生成明显多于骨缺损组、5% GelMA 组和15% GelMA 组，如图4。

图4 植入GelMA 后各组小鼠股骨缺损区（Masson 染色，n ≥3）Figure 4 Femoral defect of mice in each group after GelMA implantation （Masson staining，n ≥3）

2.2 RT-qPCR 分析

OCN mRNA 检测显示：10% GelMA 组小鼠骨缺损部位OCN 表达显著高于骨缺损组（P＜0.001）、5% GelMA 组（P＜0.01）和15% GelMA 组（P＜0.01）；5% GelMA 组和15% GelMA 组相比OCN mRNA 水平无显著差异，但都高于骨缺损组，如图5A。 Osterix mRNA 检测显示：10% GelMA 组Osterix mRNA 表达水平明显高于骨缺损组（P＜0.001）、5% GelMA 组（P＜0.001）和15% GelMA 组（P＜0.01）；5% GelMA 组和15% GelMA 组与骨缺损组相比Osterix mRNA 表达水平无显著差异，如图5B。

图5 各组小鼠骨缺损组织RT-qPCR 表达情况（n ≥3）Figure 5 Expression of RT-qPCR in bone defect tissue of mice in each group（n ≥3）

2.3 免疫组化染色分析

免疫组化染色观察成骨标志物OCN 在各组股骨缺损处的表达情况。 结果显示5% GelMA 组OCN 蛋白表达量与骨缺损组比无统计学意义；10%GelMA 组OCN 蛋白表达量明显高于骨缺损组（P＜0.01）、5% GelMA 组（P＜0.01）和15% GelMA 组（P＜0.05）；15% GelMA 组OCN 蛋白表达高于骨缺损组（P＜ 0.05），低于10% GelMA 组（P＜0.05），和5% GelMA 组比无统计学意义，如图6。

图6 各组OCN 免疫组化染色与定量分析（n ≥3）Figure 6 OCN immunohistochemical staining and quantitative analysis of each group（n ≥3）

3 讨论

骨缺损是指骨的结构完整性被破坏，常见于军事作业、创伤和骨病手术后等场景。 通常情况下，大段、大面积的骨缺损无法进行自我修复，需要借助临床技术干预。 目前临床上主要通过骨移植术修复骨缺损，但自体骨移植需要进行手术同时其材料来源有限，限制了其可用性。 同种异体骨移植与异种骨移植虽然无需额外手术同时也克服了材料限制，但可能会产生某些免疫排斥反应，影响移植骨的存活率并增加患传染疾病的风险，且受到伦理学的限制［27］。 因此，寻找更安全、有效的骨缺损修复材料，并构建适宜的动物模型对相关材料进行评价仍是骨再生领域亟待解决的重要问题。

新型光敏水凝胶材料甲基丙烯酰化明胶（GelMA）近来日益受到关注。 这种类似于天然细胞外基质（ECM）的水凝胶材料不仅能够通过刺激细胞来形成具有机械整合性的功能组织，而且还能确保移植物在植入后能继续存活［28］。 GelMA 还具有优异的生物相容性和物理可塑性［29］，与其他可用的水凝胶生物材料相比，更能满足组织再生修复的需求。 虽然GelMA 已经被应用于多种临床前场景开展研究，但是有关其在小鼠骨缺损模型中的修复作用及其评价体系报道不多，这限制了对于GelMA 支架的筛选［30］，以及修复作用相关的细胞和分子机制的评价，不利于优化可注射式骨再生支架材料的安全性和有效性。

本研究选择建立小鼠股骨缺损模型来评价GelMA 水凝胶对小鼠骨创伤的再生修复作用。 早期研究表明，颅骨血液运行较差，且离中枢神经系统较近，不利于构建复杂骨缺损模型，同时颅骨缺损模型无法用来评估骨髓腔是否再通的修复效果。在后期的长骨骨缺损模型中发现，胫骨靠近腓骨，且外观呈三角形，因此在一定程度会影响骨修复过程。 而股骨外观呈管状，内外径相对一致，与胫骨和颅骨相比可以提供如放创复合伤、骨缺合并感染等更复杂的骨缺损模型。 而且股骨作为负重骨，可以更加客观地评价骨修复过程中的力学载荷情况。因小鼠具备较强的抗感染能力，便于集中管理，且整体死亡率较低，因此本文选用小鼠股骨进行骨缺损建模［31］。 在成功建立模型的基础上，利用GelMA自身的可注射性，配置5%、10%、15%共3 个不同浓度的GelMA 体系，将其注射至小鼠股骨缺损处，待其填满整个缺损区后用紫外光源固化。 造模2 周后发现，随着支架材料降解，各组均有不同程度的新生骨组织形成。 以HE 染色和Masson 染色鉴别新生骨组织和骨胶原纤维；RT-qPCR 鉴定成骨基因OCN、Osterix mRNA 表达水平；OCN 免疫组化鉴定骨缺损处骨特异性蛋白表达情况。 最后得出结论，相比于骨缺损组、5% GelMA 组与15% GelMA 组，10% GelMA 组骨缺损处骨小梁较为成熟，缺损附近有大量新骨形成，这也通过RT-qPCR 及免疫组织染色得到了验证。 综上，本研究建立了一种简便易行的小鼠骨缺损模型，并运用此模式发现了可加速骨缺损修复的适宜浓度GelMA 可注射支架材料。

本研究结果具有较好的实践意义，一方面该模型可以用于其他材质的可注射式再生支架的体内评价，另一方面该模型可以评价携带了干细胞和生物活性因子的可注射式再生修复支架的修复效果，并开展相关机制研究。 但是，同时也应当看到，本研究的结果是基于小型实验动物得到的，大动物甚至人体临床研究的结果对于可注射式再生支架的评价更为重要，需要系统而深入的后继工作。