基于生物正交点击化学修饰吲哚菁绿用于脂肪间充质干细胞活体示踪的实验研究

何宏星廖乃顺

（1. 福建医科大学实验动物中心，福州 350004；2. 福建医科大学孟超肝胆医院，福建省孟超肝胆技术联合创新重点实验室，福州 350025）

脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissuederived mesenchymal stem cells，ADSC）是一类来源于中胚层并具有多能性的成体干细胞，具有易于体外扩增培养、组织修复功能、免疫调节功能等特性，是当前组织工程与再生医学研究的重要种子细胞［1－3］。研究表明，ADSC 移植可用于克罗恩病、骨病、肝病、移植物抗宿主病等疾病的治疗［4－7］。 然而，ADSC 作为一种“活”药物，在进入临床应用之前，应充分了解细胞移植进入体内后的分布、归巢特性，对ADSC 的疗效与生物安全性评价至关重要。 因此，开展ADSC 的活体示踪研究具有重要的科学意义。

探针标记是开展细胞活体示踪研究的关键环节［8－10］。 大多数干细胞的示踪技术主要通过探针与细胞共孵育（即细胞内吞途径）进行细胞标记［8］，这种方法需要标记的时间较长，且需要在较高剂量下达到细胞活体示踪的目的（容易带来细胞毒性）。生物正交点击化学修饰，即利用细胞糖代谢工程在细胞表面暴露叠氮基团与携带炔基的探针通过点击化学反应、实现探针的快速标记，该方法可用于细胞的快速标记，具有操作简单、标记效率高、生物相容性好等特点，是当前细胞活体示踪的主要细胞标记方法［11－12］。 吲哚菁绿（ICG）是一种已上市的近红外二区荧光染料（发射波长在700 ～ 1000 nm），在临床上广泛可用于肝功能储备评估、肝癌手术导航等［13－16］。 本文将利用生物正交点击化学修饰实现ADSC 的探针标记，以急性肝损伤小鼠为模型，开展ADSC 活体示踪的实验研究，探究ADSC 的体内分布、归巢特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

20 只SPF 级健康雄性BALB／c 小鼠，5 ～6 周龄，体重18 ～20 g，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司【SCXK（沪）2022-0004】。 动物饲养于福建医科大学实验动物中心SPF 级屏障实验室内【SYXK（闽）2022-0003】。 环境温度20 ～26℃，相对湿度40% ～70%，光照／黑暗各12 h，昼夜交替；动物自由摄食和饮水。 实验前，动物适应性饲养1 周。 实验获得福建医科大学孟超肝胆医院实验动物伦理中心审批（MCHH-AEC-2022-01）。

1.1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清（FBS）、α-MEM 培养基、青-链霉素（双抗）、0.25%胰蛋白酶购自Gibco 公司；HBSS（含钙、镁离子）、0.001 mol／L PBS 购自Hyclone 公司；CCK8 检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；4%多聚甲醛购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）生化试剂盒购自南京建成生物工程研究所；叠氮修饰甘露糖（Ac4ManNAz）、对乙酰氨基酚、戊巴比妥钠、Ⅰ型胶原酶购自Sigma-Aldrich 公司。

STR16R 型台式水平离心机（Thermo，美国），18.2 MΩ.cm 电阻率去离子制水机（Millipore，美国），微型磁力搅拌器（IKA，德国），Costar 细胞计数器（Thermo，美国），M5e 型多功能酶标仪（Molecular Devices，美国），LSM780 型激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss，德国），近红外二区小动物活体成像系统（光映美，中国）。

1.2 方法

1.2.1 ADSC 分离与培养

无菌收集腹股沟处脂肪组织，经0.001 mol／L PBS 洗涤后，将组织剪碎（约1 mm3）后，加入0.1%Ⅰ型胶原酶37℃、消化60 min。 加入完全培养基（含10% FBS、1%双抗的α-MEM 培养基）终止消化，经100 μm 筛网过滤，收集细胞消化液。 细胞悬液按1 × 105／mL 接种于T75 培养瓶，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，隔3 d 换液1 次，待细胞长满后，按1 ∶3 比例进行细胞传代，第3 ～5 代ADSC 用于后续实验。

1.2.2 生物正交点击化学修饰对ADSC 活性的影响

细胞按1 × 104个／孔接种于96 孔板中，贴壁24 h 后，添加50 μmol／L Ac4ManNAz 培养24 h 后，进行细胞换液，并添加25 μmol／L DBCO-ICG 进行点击化学修饰。 24 h 或72 h 后，添加CCK8 工作液继续培养1 h，在450 nm 处读取其吸光度值。

1.2.3 细胞的探针标记

细胞按1 × 105个／孔接种于6 孔板中，贴壁过夜后，添加50 μmol／L Ac4ManNAz 干预。 24 h 后，收集ADSC 细胞，加25 μmol／L DBCO-ICG 至37℃、30 min 进行点击化学反应。 收集经生物正交点击化学修饰的ADSC，经0.001 mol／L PBS 洗涤3 次后，加入4%多聚甲醛固定20 min，进行细胞核DAPI 复染后，利用激光共聚焦扫描显微镜拍照观察ADSC的ICG 标记情况。

1.2.4 细胞示踪

BALB／c 小鼠经一次性腹腔注射300 mg／kg 对乙酰氨基酚，进行急性肝损伤造模。 通过尾静脉注射标记ICG 的ADSC 细胞（5 × 105个／只），利用近红外二区小动物活体成像系统动态观察ADSC 移植30 min、1 d、3 d 后ADSC 的体内归巢与分布情况。另外，为进一步评估ADSC 的组织定位情况，收集经ADSC 移植3 d 后的肝组织，进行组织冰冻切片（10 μm 厚）、DAPI 染色，并利用激光共聚焦扫描显微镜拍照观察。

1.2.5 生物正交点击化学修饰对ADSC 治疗急性肝损伤疗效的影响

将急性肝损伤小鼠随机分成模型组、ADSC 组、标记ICG 的ADSC（ADSC-ICG）组，每组5 只，并设立正常对照组（5 只）。 细胞治疗组通过尾静脉回输ADSC 细胞（5 × 105个／只），对照组与模型组给予等体积生理盐水。 细胞移植2 d 后，进行标本采集与检测。 1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，眼眶静脉采血、血液经室温静置30 min 后，经4000 r／min、4℃离心10 min，收集细胞上清，并将血清样本送至福建医科大学孟超肝胆医院检验科，检测ALT、AST 含量。 收集肝组织，利用4%多聚甲醛固定24 h 后，分别进行乙醇、二甲苯脱水处理，石蜡包埋及切片、HE 染色拍照观察。

1.3 统计学分析

用SPSS 18.0 软件、单因素方差分析、LSD 方法进行统计学分析，定量资料用平均值± 标准差（±s）表示，P＜0.05 为差异有显著性。 用GraphPad Prism 7.0 进行柱状图作图。

2 结果

2.1 生物正交点击化学修饰不影响ADSC 的细胞活性

与正常的ADSC 组比较，经Ac4ManNAz、DBCOICG 的生物正交点击化学修饰24、72 h 后，ADSC 的细胞活性无明显变化（图1），说明生物正交点击化学修饰的生物相容性好。

图1 生物正交点击化学修饰后ADSC 的细胞活性分析Figure 1 ADSC viability after labeling with ICG by bio-orthogonal click chemistry

2.2 ADSC 的ICG 标记

为进一步明确生物正交点击化学修饰是否可用于ADSC 标记，以正常ADSC 为对照，将标记ICG的ADSC 进行共聚焦显微镜观察，如图2 所示，正常ADSC 无ICG 荧光信号，而生物正交点击化学修饰后，ADSC 呈现明显的ICG 荧光信号，说明生物正交点击化学修饰成功地将ICG 标记ADSC 细胞内。

图2 ADSC 经生物正交点击化学修饰ICG 后的共聚焦图Figure 2 Laser confocal microscopy images of ADSC labeled with ICG by bio-orthogonal click chemistry

2.3 ADSC 活体示踪

将标记ICG 的ADSC 经尾静脉移植到正常小鼠体内后，ADSC 细胞首先在肝富集，1 d 后，ADSC 的信号明显减少，随着时间的延长，ADSC 在移植3 d后未见明显的ADSC 的信号，说明ADSC 细胞在体内被逐步地清除；与正常组比较，将标记ICG 的ADSC 通过尾静脉注入到急性肝损伤小鼠体内，经尾静脉移植1、3 d 后ADSC 在肝组织富集的量明显增加，提示ADSC 具有较好的归巢性；但是随着时间的延长，ADSC 在受损肝组织的荧光信号逐渐减少（图3），这可能是由于较少的ADSC 能在受损肝组织中存活。

图3 基于近红外二区荧光成像的ADSC 活体示踪Figure 3 In vivo ADSC tracking by near-infrared Ⅱfluorescence imaging

2.4 ADSC 的肝组织定位

为了进一步证实ADSC 的肝向归巢性，收集经ADSC（标记ICG）移植后的肝组织进行组织定位分析。 如图4 所示，标记ICG 的ADSC 主要分布在肝组织静脉周围，提示ADSC 具有较好的肝向归巢性。

图4 ADSC 移植3 d 后在肝组织切片定位的共聚焦图Figure 4 Laser confocal microscopy images of ADSC after transplantation for 3 days

2.5 生物正交点击化学修饰ICG 对ADSC 移植治疗急性肝损伤肝功能的影响

如图5 所示，与正常组比较，小鼠血清ALT、AST 含量显著上升（P＜0.001），说明小鼠的肝功能处于急性损伤状态；与模型组比较，经ADSC 治疗后血清ALT、AST 含量显著性下调（P＜0.01），提示ADSC 可改善急性肝损伤小鼠的肝功能；与ADSC组比较，经生物正交点击化学修饰不影响ADSC 移植改善急性肝损伤肝功能的疗效，说明生物正交点击化学修饰具有良好的生物相容性。

图5 ADSC 治疗急性肝损伤小鼠的血清ALT、AST 含量Figure 5 Serum level of ALT and AST after ADSC transplantation for acute-liver injured mice

2.6 生物正交点击化学修饰ICG 对ADSC 移植治疗急性肝损伤肝功能形态的影响

如图6 所示，与正常组比较，模型组中多数肝细胞坏死，肝门静脉周围有少许炎症细胞浸润，ADSC组与ADSC-ICG 组的肝细胞坏死区域明显减少，提示ADSC 移植可以减少肝细胞坏死、改善小鼠肝组织病理形态；同时，ADSC 组与ADSC-ICG 组的肝组织病理形态无明显差异，说明生物正交点击化学修饰不影响ADSC 移植改善急性肝损伤肝显微形态的疗效。

图6 肝组织的病理学检查Figure 6 Pathological examination of liver tissues

3 讨论

点击化学反应是由卡尔·巴里·沙普利斯于2001年提出来，它是一种发生在成对试剂之间的化学反应，该化学反应于2022 年获得诺贝尔化学奖（获奖的教授包括卡罗琳·贝尔托齐、莫滕·梅尔达尔和卡尔·巴里·沙普利斯三位）［17］。 生物正交点击化学反应是利用细胞糖代谢工程、点击化学反应相结合的一种新型用于细胞靶向修饰、细胞标记的新技术［18－19］。 其中，叠氮-炔点击化学反应是细胞标记最常用的方法［20－23］。 其原理主要是细胞吞噬Ac4ManNAz 等糖分子后，经糖代谢工程暴露叠基团，然后与携带炔基的靶向分子、探针通过点击化学反应，实现细胞的靶向修饰及探针标记。 前期研究显示，利用生物正交点击化学反应将NK 细胞表面修饰具有肝癌靶向的适配体，该方法不仅不影响NK 细胞原有的功能，还可进一步提高NK 细胞向肝癌组织的归巢效率，即提高了NK 细胞治疗肝癌的移植效率，并最终增强其抗肿瘤的疗效［24］。 据此，生物正交点击化学反应可用于细胞标记及活体示踪研究。

本实验结果表明，经生物正交点击化学反应修饰，ADSC 可成功的标记ICG 荧光探针，同时该方法不影响ADSC 细胞活性，也不影响ADSC 改善急性肝损伤肝功能、肝组织病理形态的疗效，这些结果均说明生物正交点击化学反应修饰可以用于ADSC细胞标记，且其生物安全性较好。 另外，ADSC 的靶向归巢性，在前期大量的研究中已被证实，本研究发现了ADSC 可以靶向归巢至受损的肝组织内，进一步证实了ADSC 的靶向归巢性。