基于“心痛治肝”理论探讨从肝治心方调控心肌缺血再灌注损伤中铁死亡的机制

陈亚曾阳何飘谢丽华张程程王瑾茜*袁华刘莹莹朴美虹汪辛强

（1. 湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007；2. 湖南中医药大学，长沙 410208）

心肌缺血-再灌注损伤（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）是指冠状动脉部分或完全急性阻塞经再通后，血流虽恢复正常灌注，但心肌组织缺血损伤并未缓解反而进行性加重的病理过程。 因其高发病率、死亡率而成为阻碍人类健康的难题［1－2］。 心肌缺血再灌注后往往伴随血液流速及缺氧环境的快速改变，活性氧过度产生、抗氧化酶相对不足及其活性降低，均可导致脂质过氧化酶活化，引发脂质过氧化损伤，从而加剧细胞损伤和铁死亡［3］。 铁死亡是以细胞内铁代谢异常为主要诱发因素进而导致细胞内脂质活性氧（lipid-ROS，L-ROS）致死性累积，并存在细胞氧化还原反应参与的一种细胞死亡形式。 肝是主要的氧化还原及排毒的重要脏器之一。 现代医学研究表明，肝在铁的吸收、转运和储存中发挥重要作用，Fe2＋是铁在体内存在的主要形式之一，当其蓄积超量会诱使活性氧大量产生，刺激细胞膜脂质过氧化而导致铁死亡［4－8］。 而细胞铁死亡是引起心肌缺血再灌注的发作中起着关键作用［9］。

MIRI 属于胸痹心痛范畴，史上中医药治疗疗效尚佳，有其独特之处。 《黄帝内经》著有肝属木、心属火，是“母子关系”。 “心痛治肝”之法首见于明代陈士铎所著《石室秘录》中指出肝主疏泄，气机郁滞则气血不调，心脉不通或心脉挛急，遂发胸痹心痛，并提出“从肝治心、肝心并治”的治法。 研究表明，疏肝理气、活血化瘀中药复方可减轻心肌细胞炎症，修复损伤的心肌细胞，提高诊疗效果［10］。 因此本课题组认为“心痛治肝”治法具有科学依据，可能与调控铁死亡密切相关。 全国名老中医王行宽教授熟读经典结合自身临证经验，根据“心病治肝”理论遣药组方自拟从肝治心方，由柴胡、郁金、姜黄等药物组成，疏理肝气，散气破血以达推陈致新之功能［11］。 研究表明，该方药可明显改善心肌缺血患者的心功能［12－13］。 本研究采用“结扎冠状动脉左前降支＋再灌注”制备MIRI 动物模型，观察心肌组织病理形态、心肌细胞铁沉积情况及细胞铁死亡后线粒体的形态，检测血清中肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin，cTnT）、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）及多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）改变，检测心肌组织中核转录因子红系2 相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、长链脂酰辅酶 A 合成酶4 （long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4）mRNA 及蛋白表达量，以期探寻从肝治心方调控铁死亡治疗MIRI 机制所在，为“心痛治肝”理论提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

50 只SPF 级雄性健康SD 大鼠，8 ～10 周龄，体重为250 ± 20 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司【SCXK（湘）2019－0004】。 饲养于湖南中医药大学附属第一医院SPF 级动物房【SYXK（湘）2020－0010】。 饲养期间各组大鼠自由饮水，饲喂普通维持饲料由湖南嘉泰实验动物有限公司提供。饲养条件：温度22 ～26℃，相对湿度40% ～70%，保持每天12 h 光照和12 h 黑暗环境，每小时通风10 次，各组单笼喂养。 本研究所有操作均经湖南中医药大学医学伦理委员会批准（IACUC 20201010-3），实验过程遵循3R 原则。

1.1.2 药物制备

从肝治心方（红参，当归，丹参，柴胡，姜黄，郁金，白芥子，九香虫）8 味中药按2 ∶2 ∶2 ∶2 ∶2 ∶2 ∶1 ∶1比例配方，饮片购自湖南中医药大学第一附属医院，煎煮时加入处方剂量8 倍水，浸泡药材30 min 后，沸水文火煎煮2 次，每次30 min，合并药液，过滤。4℃冰箱保存。 麝香保心丸说明书：1 ～2 丸／次，每丸22.5 mg，每天3 次。

1.1.3 主要试剂与仪器

多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，20170113），CK-MB-ELISA 试剂盒96T（江苏酶免实业有限公司，FY3500-A），cTnT-ELISA 试剂盒96T（江苏酶免实业有限公司，FY40431-A），SOD-ELISA试剂盒96T（江苏酶免实业有限公司，FY3262-A），MDA-ELISA 试剂盒96T（江苏酶免实业有限公司，FY8503-A），PUFA-ELISA 试剂盒96T（江苏酶免实业有限公司，FY40437-A），NRF2 兔多抗（BIOSS，BS1074R）， ACSL4 兔多抗（Affinity， DF12141），GAPDH 鼠单抗（Immunoway，YM3029）。 酶标仪（赛默飞，Infinite F50，英国），紫外可见分光光度计（科佑，UV759，中国），电热恒温水浴锅（鼎鑫，DK-8D，中国），低速离心机（赛默飞，TDZ4-WS，英国），手动单道可调式移液器（大龙，TopPette，中国），可调移液器，枪头，离心机，恒温箱均购自于（菁华，eppendorf，中国），蛋白印迹系统（伯乐，Mini T，中国）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法及分组

50 只成模大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、从肝治心方组（CGZX 组）、麝香保心丸组（SXBX 组）5 组。 单笼喂养，自由摄食饮水。 参照课题组既往经验，空白组大鼠正常饲养，模型组、CGZX 组、SXBX 组术前12 h 禁食，于实验第1 天进行造模，具体方式如下：连接心电图电极，记录标准Ⅱ导联心电图，气管切开、插入气管插管。 连接空气呼吸机进行人工控制呼吸，开胸暴露心脏及大血管根部，以6－0 缝合线结扎冠状动脉左前降支血管，阻断30 min 后松开缝合线维持再灌注状态，随后予以止血处理及逐层缝针关胸，造模结束。 假手术组只穿线不结扎，余操作同模型组。 手术中分开胸后、结扎后、再灌注后和关胸后4 个点记录心电图变化。 以心电图ST 段的改变及左室前壁向外膨胀发绀为结扎成功标志。

1.2.2 给药

造模24 h 后，空白组、假手术组及模型组予以等体积蒸馏水灌胃，给药组按人与大鼠体表面积换算等效剂量，溶于蒸馏水灌胃，CGZX 组予以从肝治心方（6.3 g／（kg·d））灌胃，SXBX 组予以麝香保心丸混悬液（12.15 mg／（kg·d））灌胃，每天灌胃1 次，直到处死为止。

1.2.3 取材

各组均于给药后14 d（实验第16 天）8：00，参照随机数字表分别取材。 待大鼠心肌缺血再灌注完成后，立即打开大鼠的腹腔，自腹主动脉取血2 mL， 静置15 min 后分离血清，标记分类后，放至－80℃冰箱内冻存。 取血完成后即刻剖取大鼠心脏，分离缺血心肌区域。 于－80℃冰箱内保留备用。

1.2.4 检测指标

检测指标如下：（1）HE 染色观察心肌细胞损伤情况；计算心肌梗死面积。 具体公式如下：梗死面积（%） ＝ ［（左心室梗死部位心内膜长／总心内膜周长）／2 ＋（左心室梗死部位心外膜长／总心外膜周长）／2］× 100%。 （2）普鲁士蓝染色观察铁沉积情况。 （3）透射电镜下评估细胞铁死亡特点。 （4）ELISA 测定血清心肌坏死及氧化反应相关指标含量。 （5）PCR 测试心肌蛋白含量，引物序列信息见表1。 （6）Western Blot 测试心肌蛋白含量。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计软件进行分析。 实验数据以平均值± 标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，方差齐性时用LSD 检验，方差非齐性时用Dunnett’sT3 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色测心梗面积

与模型组比较，CGZX 组及SXBX 组心梗面积均明显缩小（P＜0.01），见图1。

图1 MIRI 大鼠心肌梗死面积测定Figure 1 Measurement of myocardial infarction area in MIRI rats

2.2 HE 染色观察心肌组织损伤情况

HE 染色结果显示，模型组大鼠心肌组织排列紊乱、间隙增宽，细胞部分有坏死及明显的炎性细胞浸润。 而从CGZX 组及SXBX 组细胞坏死及炎性细胞浸润较模型组明显减少；假手术组心肌组织仅有少量炎性细胞浸润，其他结构完整，见图2。

图2 各组大鼠心肌组织病理变化（HE 染色）Figure 2 Pathological changes in myocardial tissue of rats in each group （HE staining）

2.3 普鲁士蓝染色观察铁沉积情况

普鲁士染色结果显示，模型组大鼠心肌组织出现大量的黑褐色铁沉积；与模型大鼠心肌组织比较，CGZX 组铁沉积明显减少；假手术组心肌组织无明显铁沉积，见图3。

图3 各组大鼠心肌组织铁沉积情况（普鲁士蓝染色）Figure 3 Iron deposition in myocardial tissue of rats in each group （Prussian blue staining）

2.4 电镜下评估细胞铁死亡特点

模型组大鼠心肌肌丝及线粒体内部结构疏松，且伴肌丝断裂、线粒体肿胀及自噬体形成，与模型组相比，CGZX 及SXBX 组虽有断裂或疏松，但形态相对完好，嵴突疏松程度较模型组轻；假手术组大鼠心肌肌丝及线粒体结构完整，见图4。

图4 各组大鼠心肌细胞线粒体透射电镜图Figure 4 Transmission electron microscopy images of myocardial mitochondria in each group of rats

2.5 ELISA 测定血清心肌坏死及氧化反应相关指标

与空白组相比，模型组MDA、PUFA、CK-MB、cTnT 均显著升高（P＜0.01），SOD 显著下降（P＜0.01）。 与模型组相比，CGZX 组、SXBX 组MDA、PUFA、CK-MB、cTnT 均显著下降（P＜0.01），SOD显著升高（P＜0.01），见图5。

图5 各组大鼠血清心肌坏死及氧化反应相关指标含量Figure 5 Content of serum myocardial necrosis and oxidative response related indicators in each group of rats

2.6 PCR 法检测各组大鼠心肌组织Nrf2、ACSL4 mRNA 表达水平

Nrf2、ACSL4 的熔解曲线均为单峰分布，扩增曲线平滑，基本呈“S”形，提示扩增产物特异性较好。与空白组相比，模型组Nrf2 mRNA 水平明显下降，ACSL4 mRNA 水平升高（P＜0.01），提示MIRI 造模能抑制Nrf2 的表达，促进ACSL4 表达；空白组与假手术组相比，Nrf2、ACSL4 mRNA 水平差异无显著性（P＞0.05）；CGZX 组和SXBX 组Nrf2 mRNA 水平较模型组显著升高，ACSL4 mRNA 水平较模型组降低（P＜0.01），CGZX 组和SXBX 组之间差异无显著性（P＞0.05），见图6。

图6 各组大鼠心肌组织Nrf2、ACSL4 mRNA 表达水平（n ＝6）Figure 6 Expression of Nrf2 and ACSL4 mRNA in myocardium of rats in each group（n ＝6）

2.7 各组大鼠心肌组织Nrf2、ACSL4 蛋白表达水平

结果显示，与空白组相比，模型组Nrf2 蛋白水平明显下降，ACSL4 蛋白水平升高（P＜0.05），提示MIRI 造模能抑制Nrf2 的表达，促进ACSL4 表达；空白组与假手术组相比，Nrf2、ACSL4 蛋白水平差异无显著性（P＞0.05）；CGZX 组和SXBX 组Nrf2 蛋白水平较模型组明显升高，ACSL4 蛋白水平较模型组降低（P＜0.05），CGZX 组和SXBX 组之间差异无显著性（P＞0.05），提示从肝治心方和麝香保心丸可能通过促进Nrf2 的表达，抑制ACSL4 的表达来改善MIRI，见图7。

图7 各组大鼠心肌组织Nrf2、ACSL4 蛋白表达水平（n ＝6）Figure 7 Expression levels of Nrf2 and ACSL4 proteins in myocardial tissue of rats in each group （n ＝6）

3 讨论

课题组沿用前期制备的“冠状动脉前降支结扎＋缺血后再灌注”造模方式制备MIRI 模型［14］。 阳性对照组选用麝香保心丸［15］，具有治疗气滞血瘀型胸痹作用，此方已列入《2020 年冠状动脉血运重建术后心绞痛中西医结合诊疗指南》、《中成药治疗冠心病临床应用指南（2020 版）》等［16－17］，且实验证明其能改善MIRI，减轻心肌细胞铁死亡［18］。 本研究通过HE 染色发现模型组细胞水肿坏死，细胞排列不规则、疏松及大量炎性细胞浸润，透射电镜显示，模型组大鼠心肌肌丝断裂或疏松，心肌组织线粒体肿胀，内部结构疏松，同时，模型组CK-MB、cTnT 均显著升高，说明细胞铁死亡在心肌缺血再灌注损伤中起到作用。 此外，与空白组相比，模型组MDA、PUFA 显著升高，说明心肌缺血再灌注损伤铁死亡过程中存在脂质过氧化。 Nrf2 是细胞氧化应激反应的核心调节者，可平衡氧化还原，减轻细胞损伤［19－23］；而ACSL4 铁死亡易感性的关键预测因子，可作为铁死亡标志物［24－27］。 因此本研究选择Nrf2-ACSL4 作为铁死亡的调控通路观察，结果显示模型组大鼠心肌组织Nrf2 mRNA 及蛋白水平较空白组明显下降，ACSL4 mRNA 及蛋白水平升高，表明Nrf2-ACSL4 可能是心肌缺血再灌注损伤铁死亡的信号通路。

随后，本研究通过HE 染色观察到，与模型组相比，CGZX 组与SXBX 组均可显著减少梗死面积；CGZX 组心肌组织水肿变性减少，炎症细胞浸润减轻；且CGZX 组血清CK-MB、cTnT 表达下降，透射电镜显示CGZX 组大鼠心肌组织线粒体肿胀轻，提示从肝治心组方干预可降低心肌缺血损伤程度；CGZX组血清中SOD 显著升高，MDA、PUFA 显著下调，提示从肝治心方可调节脂质过氧化反应；普鲁士蓝染色显示CGZX 组铁沉积明显减少；且铁死亡标志物ACSL4 mRNA 及蛋白水平下调，Nrf2 mRNA 及蛋白水平较模型组显著升高，与麝香保心丸组相比，差异无统计学意义，表明CGZX 与SXBX 组均可通过调控ACSL4、Nrf2 水平实现抑制铁死亡的作用。 综上，依据“心痛治肝”治法的从肝治心方减轻心肌细胞损伤可能通过改善铁代谢异常及调节脂质过氧化反应抑制铁死亡，且机制与上调Nrf2、下调ACSL4有关，可为“心痛治肝”理论提供实验依据。

本研究结果提示CGZX 方调控铁死亡可能与调控Nrf2-ACSL4 的表达平衡氧化还原，改善脂质代谢有关，同时证实肝主疏泄功能，可促进铁及脂质代谢，从而减轻细胞损伤，改善心肌缺血。