β-arrestin2基因敲除对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

陈婷婷单杉李南汪子颖杞萌张胜男胡姗姗魏伟孙妩弋

(安徽医科大学临床药理研究所,抗炎免疫药物教育部重点实验室,抗炎免疫药物安徽省协同创新中心,合肥 230032)

巨噬细胞是参与炎症免疫反应的重要效应细胞之一,具有呈递抗原、分泌细胞因子等功能,从而调控机体微环境,发挥免疫调节作用。巨噬细胞具有高度可塑性,经过不同的刺激后,可以分化为特定的表型,包括经典活化的M1型巨噬细胞和选择性活化的M2型巨噬细胞[1]。M1型巨噬细胞主要表达CD86等基因,能够帮助宿主抵御病毒和微生物的感染,抑制肿瘤,产生多种炎症因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)等,进而参与炎症及免疫反应[2-3]。腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,pMφ)作为腹腔内最主要的细胞类型之一,参与了腹腔内各种类型的免疫炎症反应。已有研究报道,pMφ与腹膜炎以及腹膜炎引起的全身性脓毒血症、腹腔器官胰腺、肠道等炎症性疾病密切相关[4]。因此,更好地了解pMφ的特征和功能对于炎症免疫反应相关疾病的治疗具有重要意义。

β-arrestin2广泛表达于哺乳动物的组织细胞和免疫细胞中,是一种重要的接头蛋白和信号转导调控蛋白,其在细胞增殖、迁移、凋亡和炎症反应中发挥重要的调节作用[5-6]。然而,β-arrestin2对pMφ功能的影响尚未见相关报道。本研究采用βarrestin2基因敲除小鼠(β-arrestin2-/-),观察βarrestin2基因敲除对小鼠pMφ功能的影响,初步探讨β-arrestin2调控pMφ功能的可能机制,为后续深入研究β-arrestin2在免疫应答和相关临床疾病中的作用提供前期实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

4只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性β-arrestin2-/-小鼠,6～8周龄,体重约为20 g。购自美国Jackson实验室【1511A06788】,遗传背景C57BL/6J。8只SPF级雌性野生型(wide type,WT)C57BL/6J小鼠,6～8周龄,体重约为20 g,购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司【SCXK(苏)2018-0008】。实验动物在安徽医科大学临床药理研究所SPF级动物房饲养及繁育【SYXK(皖)2020-001】,给予动物自由饮水与摄食,饲养环境温度20～25℃,湿度40%～70%,光照12 h。所有操作经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准(审批号:LLSC20200794)。

1.1.2 主要试剂与仪器

RPMI 1640培养基(以色列 Biological Industries,01-100-1ACS),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(美国Sigma,L2880),胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,11011-8611),Transwell小室(美国Corning,3422),中性红(大连美仑生物技术有限公司,MB4613),APC标记的Anti-CD86(美国Biolegend,105113),小鼠TNFα、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公 司,ml002095、ml063132、ml002293),Anti-βarrestin2(美国Affinity,DF6305)、Anti-p-JAK1(美国Affinity,AF2012)、Anti-JAK1(美国 Affinity,AF5012)、Anti-STAT1(美国Affinity,AF6300)、Antiβ-actin(美国Affinity,AF7018),Anti-p-STAT1(英国Abcam,ab109461)。

Infinite M1000 PRO多功能酶标仪(TECAN,瑞士),Image Quant化学发光成像系统(GE,美国),CytoFLEX流式细胞仪(Beckman,美国),BX53正置显微镜(Olympus,日本),BIO-RAD powerpac164-5070电泳仪(BIO-RAD,美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物的繁育鉴定

将β-arrestin2-/-雄性小鼠与WT雌性小鼠1∶2比例合笼,饲养过程中,每日观察和记录小鼠的生长情况,每周更换2次垫料,及时补充饲料和饮用水。将繁殖出的F1代杂合子小鼠继续进行合笼,获得的F2代小鼠按本实验室此前方法进行基因型检测[7],筛选出年龄和性别匹配的同窝βarrestin2-/-小鼠和WT对照小鼠进行实验。

1.2.2 pMφ的分离提取及分组处理

pMφ的提取参照耿田欣等[8]方法,颈椎脱臼处死小鼠后,无菌条件下磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)灌洗并收集腹腔液。1000 rpm离心10 min,所得细胞沉淀用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合溶液)重悬接种至6孔板中,于37℃培养4 h后,洗去未贴壁细胞,余下的贴壁细胞即为pMφ,并在显微镜下观察细胞形态。体外使用LPS(终浓度100 ng/mL)刺激pMφ,分为WT对照组(WT control)、LPS刺激组(WT+LPS)、β-arrestin2基因敲除对照组(βarrestin2-/-control)、β-arrestin2基因敲除刺激组(βarrestin2-/-+LPS),每组5只小鼠。

1.2.3 Transwell法检测pMφ的迁移能力

用RPMI 1640无血清培养基重悬细胞,并调整细胞密度为每毫升1×105个,将100μL细胞悬液加入上室,下室加入500μL含10%血清的培养基,培养24 h后,用湿棉签擦拭小室内部未迁移的细胞,PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定30 min。0.01%结晶紫染色液染色30 min,PBS清洗3次,晾干,在显微镜下观察膜底细胞拍照计数。

1.2.4 中性红吞噬实验检测pMφ的吞噬功能

将细胞悬液的密度调整为每毫升5×104个,接种于96孔板中,每孔100μL,培养24 h后,PBS清洗3次,加入0.075%中性红溶液100μL,继续培养2 h后,弃去中性红溶液,PBS洗3次,加入100 μL细胞裂解液(50%乙醇∶50%乙酸=1∶1),4℃过夜,酶标仪检测波长为540 nm处的吸光度(OD)值。

1.2.5 流式细胞术检测pMφ表面分子CD86的变化

LPS刺激后收集细胞,PBS洗1遍,1200 rpm离心5 min,弃上清,加入50μL PBS重悬细胞,再加入1μL CD86-APC荧光标记抗体,4℃避光孵育30 min,PBS洗1遍,加入300μL PBS重悬,流式细胞仪检测。

1.2.6 ELISA检测pMφ炎性细胞因子的释放量

细胞分组处理后,收集细胞上清液,采用ELISA试剂盒检测pMφ分泌炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。操作按照试剂盒说明书步骤进行,配制并滴加标准品、上清液样品,再依次加入酶标试剂及显色剂A、B,酶标仪检测OD值,按照说明书绘制标准曲线,并计算炎性因子含量。

1.2.7 Western Blot法检测pMφ中β-arrestin2、JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1的表达

收集细胞,提取蛋白。配制10%的SDS-PAGE凝胶,上样进行电泳,转移至PVDF膜上,用含0.05%吐温20的PBS配制的5%脱脂牛奶封闭PVDF膜,37℃摇床封闭2 h,孵育抗β-arrestin2、JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1、β-actin抗体,4℃过夜,洗去一抗后,37℃孵育二抗2 h后,洗去二抗,化学发光成像系统显影。采用Image J图像分析软件进行结果分析,测得条带的灰度值,计算各组目的条带与内参β-actin的比值以反映目的蛋白表达水平,比较各组间差异。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。结果用平均值±标准差(±s)表示,多组间的差异比较采用单因素方差分析,GraphPad Prism 8.0绘制柱状图,P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 β-arrestin2敲除对小鼠pMφ的形态的影响

倒置显微镜下观察了贴壁后pMφ的细胞形态。结果显示,WT组小鼠pMφ呈圆形,部分细胞出现伪足,呈梭形。而β-arrestin2-/-组小鼠pMφ多呈圆形,边缘光滑,较少见伪足(见图1)。

图1 pMφ的形态学观察Figure 1 Morphological observation of pMφ

2.2 β-arrestin2敲除对小鼠p Mφ的迁移能力的影响

为了研究β-arrestin2是否参与了pMφ迁移过程,通过Transwell迁移实验检测β-arrestin2基因敲除对pMφ迁移的影响。结果如图2所示,与未刺激的对照组pMφ相比,LPS刺激后pMφ的细胞迁移数目明显增加;与WT组pMφ相比,β-arrestin2基因敲除明显减少了pMφ的细胞迁移数目(P＜0.01)。提示β-arrestin2基因敲除可以抑制pMφ的迁移能力。

图2 β-arrestin2基因敲除对pMφ迁移能力的影响Figure 2 Effect ofβ-arrestin2 deficiency on the migration ability of pMφ

2.3 β-arrestin2敲除对小鼠p Mφ吞噬功能的影响

吞噬功能被认为是巨噬细胞参与免疫反应的重要指标之一,因此我们采用了中性红实验检测βarrestin2基因敲除对pMφ吞噬功能的影响。结果如图3所示,与未刺激的对照组相比,LPS刺激明显升高pMφ的吞噬指数(P＜0.01);与WT组pMφ相比,β-arrestin2基因敲除后显著提高了小鼠pMφ的吞噬指数(P＜0.01)。以上结果提示β-arrestin2基因敲除可以增强巨噬细胞的吞噬功能。

图3 β-arrestin2基因敲除对pMφ吞噬功能的影响Figure 3 Effect ofβ-arrestin2 deficiency on the phagocytic ability of pMφ

2.4 β-arrestin2敲除对小鼠pMφ表面分子CD86表达的影响

CD86作为M1型巨噬细胞的表面标志,其表达水平与巨噬细胞的极化程度密切相关[9]。为了探究β-arrestin2基因敲除对M1型巨噬细胞极化的影响,使用流式细胞仪检测pMφ表面分子CD86的水平变化。结果如图4显示,与未刺激的对照组相比,LPS刺激后,小鼠pMφ表面分子CD86的表达均明显升高;与WT组相比,β-arrestin2基因敲除后明显增加了CD86的表达水平(P＜0.01),提示β-arrestin2可能参与了LPS诱导的M1型巨噬细胞的极化过程。

图4 β-arrestin2基因敲除对小鼠pMφ表面分子CD86表达的影响Figure 4 Effect ofβ-arrestin2 deficiency on the expression of CD86 on the surface of mouse pMφ

2.5 β-arrestin2敲除对小鼠pMφ炎性因子分泌量的影响

极化的M1型巨噬细胞可以分泌大量的炎性因子,为了进一步验证β-arrestin2基因敲除对pMφ极化能力的影响,我们使用ELISA试剂盒检测βarrestin2基因敲除对pMφ分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响。结果如图5所示,与对照组相比,LPS刺激后,小鼠pMφ中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌量明显升高(P＜0.01);与WT组pMφ相比,β-arrestin2基因敲除明显上调了pMφ中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平(P＜0.01)。

图5 β-arrestin2基因敲除对pMφ分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的影响Figure 5 Effects ofβ-arrestin2 deficiency on the production of IL-1β,IL-6 and TNF-αby pMφ

2.6 β-arrestin2敲除对JAK1/STAT1信号通路的影响

为了进一步阐明β-arrestin2基因敲除对pMφ功能影响的可能机制,我们通过Western Blot法检测了JAK1/STAT1通路相关蛋白的水平变化。结果显示,β-arrestin2-/-组 pMφ 中几乎不表达 βarrestin2;WT组中,在LPS的刺激下,β-arrestin2的表达较对照组明显降低(图6A,P＜0.01),提示在炎性环境下,β-arrestin2在pMφ功能调控中发挥作用。与未刺激的对照组相比,LPS刺激后p-JAK1和p-STAT1的表达明显上升(图6B,P＜0.01);与WT组pMφ相比,β-arrestin2基因敲除后明显促进了p-JAK1和p-STAT1表达(图6B,P＜0.01)。以上结果提示β-arrestin2基因敲除可以促进pMφ中JAK1/STAT1通路的激活。

图6 β-arrestin2基因敲除对小鼠pMφ中JAK1/STAT1通路基因变化的影响Figure 6 Effects ofβ-arrestin2 deficiency on the expression changes of JAK1/STAT1 pathway in pMφ

3 讨论

巨噬细胞是固有免疫系统的重要组分,在炎症、防御、修复、代谢等生理过程中至关重要[9]。迄今为止,最常见的巨噬细胞来源是骨髓、脾和腹腔。从腹腔中分离的pMφ是进行体外模拟炎性刺激、细胞信号检测、吞噬作用、毒理学等研究常用的巨噬细胞来源[10]。越来越多的研究表明,pMφ的免疫及炎症反应与各种炎症性疾病和癌症的致病过程密切相关[11-12]。这些研究提示,研究pMφ的功能调控,不仅有利于深入探讨固有免疫应答的具体机制,对于相关腹腔器官炎症性疾病乃至全身感染性疾病的治疗也具有重要意义。

β-arrestin2作为细胞中重要的接头蛋白和信号转导调控蛋白,与多种疾病的发生、发展存在联系,如内分泌疾病、肿瘤和纤维化疾病等[13]。已有研究发现β-arrestin2在脾和白细胞中高度表达,提示其在调节免疫系统功能方面可能具有重要作用[14]。目前陆续有研究报道β-arrestin2参与CD4+T淋巴细胞、中性粒细胞等多种免疫细胞的功能调节[15]。因此,本实验选择了小鼠pMφ作为研究对象,采用体外细胞培养的方法,观察了β-arrestin2对pMφ功能的调节作用。本研究发现在LPS的刺激下,WT小鼠的pMφ中β-arrestin2的表达水平明显下降,提示β-arrestin2可能与pMφ的功能调控有关。巨噬细胞的迁移是其发挥生物学功能的过程中必不可少的环节之一,经LPS刺激活化后的巨噬细胞的迁移能力明显增强,会迅速募集到炎症感染部位,从而参与机体的炎症免疫反应[16]。β-arrestin2作为一种支架蛋白,在介导细胞肌动蛋白骨架重排,调节各类免疫细胞迁移过程中具有重要影响,研究表明,β-arrestin2基因敲除后,Th2细胞的迁移能力明显降低[17];此外,在缺失β-arrestin2基因的淋巴细胞中,T、B细胞的迁移能力也明显降低[18]。那么,β-arrestin2对pMφ的迁移能力是否有影响呢?本研究Transwell实验发现,β-arrestin2基因敲除可以明显降低pMφ的迁移能力。吞噬功能也是检测巨噬细胞功能的重要指标,活化的巨噬细胞不仅可以分泌特定的细胞因子参与机体的炎症反应,其吞噬功能也进一步增强,在机体的非特异性免疫应答中起到重要作用[19]。我们采用中性红实验观察了βarrestin2对pMφ的吞噬功能的影响,研究发现,βarrestin2基因敲除可以明显提升pMφ的吞噬功能。细胞因子的合成和分泌是反映巨噬细胞极化的重要标志,巨噬细胞极化后可合成和分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子,参与固有免疫及适应性免疫应答的启动[20]。本研究表明β-arrestin2基因敲除后,LPS诱导的M1型巨噬细胞极化相关分子CD86的表达也明显增加,同时pMφ释放的炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6的水平也明显上升。这些结果表明β-arrestin2可能还参与了pMφ分泌炎性因子和极化的调控过程。

大量研究表明,JAK/STAT在多种炎症因子刺激下激活,进而发挥信号转导和转录调控作用,影响巨噬细胞的免疫功能[21]。已有研究表明,抑制JAK1/STAT1信号通路的激活,可以下调巨噬细胞表面吞噬受体的表达,从而显著抑制人源单核细胞株THP-1诱导成的巨噬细胞的吞噬功能[22]。此外,在体外LPS诱导的炎症模型中,JAK1和STAT1的磷酸化程度明显升高,从而促进了RAW264.7巨噬细胞向M1型的极化[23];另有文献报道,在LPS诱导的内毒素休克模型中,与WT小鼠相比,STAT1基因缺失的小鼠具有明显的抵抗性,M1型巨噬细胞极化和炎性分子的分泌程度也明显降低[24]。在急性结肠炎中,选择性抑制JAK1的活性可以显著抑制骨髓源性巨噬细胞中STAT1的信号转导和M1型巨噬细胞的极化程度[25]。提示JAK1/STAT1通路是调控巨噬细胞极化的关键性通路之一。另有研究表明,在体外用LPS诱导建立小胶质细胞活化模型,β-arrestin2高表达后能明显抑制STAT1信号通路的活化,同时,下调β-arrestin2在骨髓源性巨噬细胞的表达,可以促进STAT1信号通路的激活[26-27]。那么在pMφ中,β-arrestin2是否通过影响JAK1/STAT1信号通路参与调控pMφ的功能呢?本研究通过Western Blot检测发现,与WT组相比,βarrestin2基因敲除后可以增强JAK1和STAT1的磷酸化程度,提示β-arrestin2敲除可以促进pMφ中JAK1/STAT1信号通路的激活。

综上所述,本研究发现了β-arrestin2基因敲除后,pMφ的迁移能力、吞噬功能、炎性细胞因子的释放以及极化能力明显发生改变,提示β-arrestin2可能参与了pMφ功能的调控过程,其作用可能是通过调控JAK1/STAT1信号通路来实现的。这一发现为今后深入探讨β-arrestin2在巨噬细胞功能中的发挥的作用,以及相关临床疾病的机制探究提供了重要的实验依据。