不同体重对正常饮食下小鼠腹主动脉瘤进展影响的回顾性研究

刘懿田康利夏聪聪刘浩乐付维来许杨威白亮刘恩岐赵四海*

(1.西安交通大学医学部实验动物中心,西安 710061;2.天津医科大学第二医院血管外科,天津 300211)

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是指各种致病危险因素引起的腹主动脉局部扩张,导致动脉直径超过正常值的50%[1-2]。AAA的危险因素主要包括了吸烟、年龄、性别、家族遗传史和高血压等,其最终发病是遗传因素和生活习惯共同引起[3]。由于目前提供给动脉瘤病人的有效的药物治疗措施尚未建立,外科治疗仍是目前有效治疗手段[2,4-5]。各种原因导致的突发动脉瘤破裂死亡率可达到80%以上,很多病人没有来的及入院或在入院不久死亡,AAA已经成为一种严重影响人们健康的疾病[1-4]。随着我国社会的快速发展,国人肥胖或者亚肥胖人数在逐渐增加,而超重和很多疾病,包括动脉粥样硬化和糖尿病等,都呈现出正相关,已经成为一个重要的疾病危险因素[6-8]。虽然AAA和动脉粥样硬化都是常见的外周血管病,但两者在发病机制上很多不同,关于超重/肥胖是否也可以促进AAA进展,目前临床数据分析结果不一致,尚未有定论[9-11]。在实验室,模拟AAA的动物模型有多种,包含猪胰弹性蛋白酶(porcine pancreatic elastase,PPE)灌注法、血管紧张素(Angiotensin II,Ang II)输注法和氯化钙涂抹法等,而前两种方法又更为常用[12-14]。有研究显示,通过高脂饮食诱导的超重或肥胖可以促进Ang II诱导的小鼠AAA的形成,提升该方法的成模率[15]。在实际工作中,饲喂正常饮食情况下,即使是相近周龄的近交系小鼠,由于母鼠产仔个数、营养和后天发育的差别,体重也不尽相同,是否不同体重也会影响AAA的造模成功率和疾病进展?为了回答该问题,我们回顾性分析了本实验室2021年以来用作对照组的PPE诱导的AAA模型小鼠,探究体重是否可以影响AAA的发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本研究所用45只SPF级雄性C57BL/6小鼠(模型组44只,正常对照组1只用于组织学观察),10～14周龄,体重24～32 g,均来自于西安交通大学实验动物中心【SCXK(陕)2018-001】。饲养于西安交通大学实验动物中心【SYXK(陕)2020-005】,饲养期间各组小鼠自由饮水,饮食。饲养环境:昼夜各半循环照明,湿度恒定,温度控制在22～25℃。所有操作均符合西安交通大学实验动物伦理学要求(审批号:2019-1178)。

1.1.2 主要试剂与仪器

PPE(Sigma,E1250)用PBS配置成1.5 U/mL工作液。平滑肌细胞 α-actin抗体(Novus Biologicals,NB300-978),巨噬细胞(CD68)抗体(BioLegend,137002),CD31抗体(BioLegend,100402),MMP-2抗体(R&D Systems,AF1488),MMP-9抗体(R&D Systems,AF909),生物素标记羊抗大鼠二抗(VECTOR,BA-9400),生物素标记驴抗羊二抗(Jackson ImmunoResearch,705-065-003),链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(Jackson Immuno Research,016-030-084),AEC试剂盒(VECTOR,SK-4200),苏木素伊红(HE)染液(武汉赛维尔生物科技有限公司,G1005),冷冻包埋剂OCT(SAKURA,4583),其他试剂均为国产分析纯,弹力纤维染液为国产相关试剂配制。

手术显微镜(上海玉研,型号:YAN-4A);手术显微镜照相机(麦克奥迪,型号:ProS5 Lite);冰冻切片机(Leica,型号:CM1950);生物显微镜(Nikon,型号:80i);生物显微镜照相机(Olympus,型号:DP72)和图像分析软件(Mitani,WinRoof 6.5),图表制作和数据分析软件(Prism7.0)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及实验干预

回顾性分析本实验室2021年1月以来44只PPE诱导的AAA小鼠模型体重和成瘤后腹主动脉直径数据,先用Prism 7.0进行两者相关性回归分析。然后根据小鼠体重分布(23.9～32.1 g),将正常饮食小鼠根据体重筛选出两组,纳入体重＜25 g的小鼠作为模型1组(正常饮食体重较轻者,n=8)和体重＞30 g的小鼠作为模型2组(正常饮食体重较重者,n=8)。PPE诱导小鼠AAA模型方法如下:小鼠称重后,转入到诱导麻醉盒中做术前预麻醉。小鼠麻醉后,转移至手术平台,继续面罩吸入麻醉。将小鼠取仰卧位固定,脱毛剂去掉腹部被毛,手术区皮肤用碘酒消毒,腹部正中切开长约2～3 cm,拨开腹腔内容物,暴露肾下腹主动脉至髂动脉分叉处,结扎侧支血管,游离出准备灌注的腹主动脉段。手术段腹主动脉放置3根8-0丝线,上下游活结结扎。用8-0缝合针头在髂动脉分叉结扎线临近处扎破血管,清理溢出血液,用显微手术镊将套管(PE-10)经血管刺破口处插入动脉。中游结扎线结扎固定插管后,注射泵迅速注射约30μL PPE,灌注持续5 min后,拔出插管,11-0丝线缝合动脉切口,重建下肢血流,关闭腹腔。术后将小鼠笼盒放于温暖环境保暖,待小鼠活动正常后放回饲养室,整个手术过程在体式显微镜下完成。

1.2.2 动脉直径测量及取材

对于接受手术并进行PPE灌注的小鼠,术前(记为0 d)及术后14 d用显微镜照相机进行腹主动脉拍照和直径测量。根据镜下观察和动脉直径测量结果,血管直径扩张超过50%以上判定为AAA。术后14 d后安乐死小鼠,取AAA段血管,新鲜组织用OCT包埋,冰冻切片机连续切片(5μm)备用。分离小鼠皮下、附睾周围和背部脂肪,称取组织湿重。

1.2.3 腹主动脉瘤病变组织学检测和分析

组织切片分别进行HE、弹力纤维和Masson染色,免疫组织化学染色采用生物素-链霉亲和素过氧化物酶法,包括血管平滑肌细胞、巨噬细胞、新生血管、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和MMP-9染色。在进行组织学评价中,从轻度到重度分为四个级别(I-IV)进行评价。以弹力纤维破坏为例,I级:弹力纤维层破坏和血管平滑肌细胞减少等损伤仅局限于1层弹力纤维层;II级:损伤涉及两层或全部,但仅限于1/4血管;III级:损伤涉及所有弹力纤维层,但仅限于1/2血管以下;IV级:损伤涉及所有弹力纤维层并延伸至3/4血管以上。平滑肌细胞耗竭和巨噬细胞染色阳性细胞数量显示血管壁炎性反应程度,可根据浸润的面积和部分分为4个级别(I-IV),其标准同上。对于外膜血管新生(CD31标记)采用镜下计数新生血管数量的方法分析、MMP-2和MMP-9的免疫组织化学染色结果利用软件计算阳性着色面积。

1.3 统计学分析

结果用平均值±标准差(±s)表示,所有数据采用GraphPad Prism 7.0进行统计学分析,两组比较数据先进行正态检验,符合正态检验情况下采用两组均数t检验,以P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 小鼠体重与AAA成瘤和血管直径变化的相关性分析

如图1A所示,我们回顾性分析纳入了本实验室2021年1月以来44只PPE诱导的AAA小鼠模型体重和成瘤后腹主动脉直径数据,然后进行相关性分析发现术前体重和术后血管扩张程度相关系数只有0.005,相关系数较低。根据体重将纳入小鼠分为体重偏轻的模型1组和体重较大的模型2组,两组平均体重分别为24.5 g和31.1 g(图1B)。PPE灌注手术后14 d,分离小鼠不同部位脂肪,称取湿重发现两组小鼠在不同部位脂肪重量均有显著性差异(图1C)。进一步分析术后血管直径,可以看到两组小鼠在PPE灌注手术后14 d均出现了灌注段血管扩张,模型1组平均从0.50 mm左右扩张到1.35 mm,模型2组平均从0.55 mm左右扩张到1.27 mm(图1D)。两组小鼠血管直径相比术前均有显著性差异,达到血管瘤诊断标准,但相同时间节点上,两组小鼠血管直径差异不大,未见体重对AAA成瘤有大的影响(图1E)。同样,我们也分析了两组小鼠血管直径变化的情况,将手术后14 d血管直径减去术前直径,两组小鼠血管直径变化的差异也不显著(图1F)。

图1 正常饮食小鼠体重与腹主动脉瘤直径相关性分析Figure 1 Correlation analysis between body weight and AAA diameter in normal diet feeding mice

2.2 不同体重小鼠AAA组织学比较

如图2所示,正常血管镜下可见结构清晰,平滑肌细胞排列整齐,弹力纤维连续整齐。两组PPE模型小鼠的血管腔明显扩大,平滑肌细胞着色变浅,甚至消失,可见明显的炎症细胞弥散性浸润,血管结构紊乱。两组小鼠在具体病变特征上差异不大,均呈现血管腔增大、血管结构改变和炎症细胞浸润特征。正常血管弹力纤维染色一般可见小鼠腹主动脉有4层左右的弹力纤维层,弹力纤维呈现规律性的弯曲。PPE模型小鼠弹力纤维破坏较为严重,中膜弹力纤维多断裂、退行性变、甚至消失或只留下残迹,经组织学评分,本实验模型1组8只小鼠中,2只评分为III级,6只评分为IV级;模型2组8只小鼠中,3只评分为III级,5只评分为IV级,损伤涉及所有弹力纤维层。

图2 正常饮食下不同体重小鼠AAA组织学比较Figure 2 Histological comparison of AAA in different body weight mice

2.3 不同体重小鼠AAA瘤体平滑肌细胞损耗和巨噬细胞浸润比较

以平滑肌α-actin标记平滑肌细胞,免疫组织化学染色结果显示正常血管平滑肌层呈现典型的环状结构着色,平滑肌细胞和弹性纤维排列规律(图3)。相比于正常腹主动脉,PPE灌注小鼠血管显示平滑肌细胞损耗殆尽,着色很浅。模型1组和模型2组差别不大,其中模型1组8只小鼠,有1只损伤评分为III级,7只评分为IV级;模型2组有2只损伤评分为III级,6只评分为IV级。和平滑肌细胞组织学评价结果类似,巨噬细胞(CD68标记)浸润在两个模型组也非常严重,其中模型1组8只小鼠评分为IV级;模型2组有1只损伤评分为III级,7只评分为IV级。正常血管巨噬细胞染色偶见阳性着色细胞,分析可能为血管局部定居的炎症细胞。

图3 正常饮食下不同体重小鼠AAA组织平滑肌细胞和巨噬细胞染色Figure 3 Immunohistochemical staining of smooth muscle cells and macrophages

2.4 不同体重小鼠AAA瘤体MMP-2和MMP-9表达比较

MMPs在AAA起始和进展中扮演重要角色,在炎症反应和血管重塑等进程中均起到重要作用。如图4所示,正常血管的MMP-2和MMP-9表达很少,即使是血管周围定居的巨噬细胞等炎性细胞也未见表达。相比于正常动脉血管,PPE灌注小鼠腹主动脉瘤体组织MMP-2和MMP-9升高,其与炎症细胞浸润,尤其是巨噬细胞的浸润有很大关系,在表达位置上也多有重合,在血管重塑发挥着重要作用。但在不同体重小鼠,这两个基质金属蛋白酶表达水平差异并不显著。

图4 正常饮食下不同体重小鼠AAA组织MMP-2和MMP-9染色Figure 4 Immunohistochemical staining of MMP-2 and MMP-9 in AAA tissues

2.5 不同体重小鼠AAA瘤体血管新生的比较

异常血管新生也是AAA的重要特征之一,血管新生异常在AAA进展中发挥了重要作用。如图5所示,用CD31标记血管内皮细胞,观察新生血管情况正常血管除管腔侧内皮着色外,血管其他部位未见明显的新生血管。而在模型1组和模型2组小鼠,可见血管外膜有数量众多的新生血管,AAA瘤体部位伴有异常血管新生。通过统计模型1组和模型2组新生血管的数量,模型1组稍多于模型2组,但无统计学差异。

图5 正常饮食下不同体重小鼠AAA组织血管新生观察Figure 5 Angiogenesis in AAA tissues of normal diet feeding mice

3 讨论

在本研究中,我们通过回顾本实验PPE制备的AAA小鼠模型状况,专注分析了正常饮食下,体重这一因素在AAA进展中可能起到的作用。在AAA相关研究中,PPE诱导模型是最常用的模型之一[12-13]。相比其他模型,PPE模型较好的模拟了炎症反应参与AAA进展的情况,而且弹力纤维断裂/降解和平滑肌细胞凋亡消失等组织学表现也很典型[13,16]。一般来讲,可选用8周龄以上小鼠用PPE灌注来进行AAA造模,进而开展后续研究[12,16]。文献报道超重和肥胖可以影响小鼠AAA的进展[15]。在正常饮食饲养状态下,相同或相近周龄小鼠,其体重也有差异,是否在AAA造模的时候需要考虑体重这一因素的影响?为了回答这一问题,我们通过回顾本实验室数据,初步分析了在正常饮食情况下,小鼠体重差异对PPE诱导的AAA影响。分析结果显示两者相关性较小。

以往基于小鼠的研究认为肥胖可以促进夹层AAA的进展,所采用的模型是Ang II模型,该模型一般均伴随主动脉夹层[13,17]。但在Ang II诱导的模型中,高脂血症是必须的,但在人类,高脂血症和动脉瘤的关系仍未明确定论[17]。而PPE模型在野生型小鼠上即可诱导,不依赖于高脂血症,避免了这一混杂因素带来的困扰。流行病学研究对于肥胖或超重是否促进AAA进展,也仍未完全获得一致结论。在研究体重和AAA的关系上,只有腰臀比可能和AAA发展呈正相关[9]。由于流行病学研究结果的不一致,超重或肥胖和腹主动脉瘤进展的关系尚需进一步明确[9-11]。在本次研究中,虽然只是涉及到正常饮食的小鼠,在自然体重差异情况下,并未观察到体重差异对AAA的明显影响。这可能和PPE模型造模因素中不涉及血脂及其相关代谢变化有关。由于本回顾分析中纳入的均是正常饮食小鼠,两个模型组体重差异基本涵盖了10～14周龄小鼠正常体重的范围,结果证实体重正常范围内的差异对AAA的影响有限,这为我们在进行造模时候对动物体重的选择具有参考意义。

体重增加和糖尿病呈正相关,两者是相互促进的关系。但令人意外的是,越来越多的临床证据证明,糖尿病却对动脉瘤的进展起到抑制作用,而在动物实验也得到验证[18-19]。在本实验中,我们未观察到体重对AAA的明显影响,虽然统计学差异并不显著,体重小的模型1组在PPE造模后,其血管直径变化比体重较大的模型2组稍大一些。在本实验中,我们使用的是正常饮食小鼠,并未诱导肥胖,将来的实验中可以考虑尝试在肥胖小鼠中研究肥胖对AAA的影响。总之,本实验明确了正常饮食情况下,体重并未对AAA的形成和发展造成显著影响,正常范围内的体重差异不对PPE诱导小鼠AAA模型的稳定性造成困扰。