甲炎康泰颗粒剂对自身免疫性甲状腺炎大鼠免疫相关细胞因子的影响

潘雅婧张秋娥张程斐吴丽丽秦灵灵胡凯文*刘铜华*

(1.北京中医药大学东方医院,北京 100078;2.北京中医药大学中医养生学北京市重点实验室,北京 100029;3.陕西中医药大学第一临床医学院,西安 711301)

自身免疫性甲状腺疾病是临床常见的一类器官特异性自身免疫性疾病,主要包括桥本氏甲状腺炎、Graves’病等[1-2],发病与遗传易感性、环境因素、情绪压力等因素相关,发病率因年龄、性别、种族、地域而异[3-4]。流行病学调查显示,自身免疫性甲状腺疾病在女性人群发病率为5%～15%,在男性人群发病率1%～5%,且遗传率较高(55%～75%)[4]。自身免疫性甲状腺疾病是临床甲状腺功能异常主要原因,对包括甲状腺在内的全身多器官和系统造成损害,影响患者生活质量。现代医学以对症治疗为主,包括饮食管控、甲状腺素替代治疗、糖皮质激素或免疫调节剂治疗和外科手术等[5-6]。在缓解症状、改善生活质量等方面仍缺乏有针对性的、安全有效的药物,中医药治疗在降低抗体滴度、改善临床症状、缓解甲状腺肿大、缩短病程等方面有独特优势[7]。

甲炎康泰为北京中医药大学东方医院院内制剂,已获国家专利(专利号ZL 201610642433.6),由柴胡、郁金、夏枯草、穿山龙、浙贝母、玄参、山慈菇、黄芪、乌梅九味中药组成,具有疏肝解郁、化痰祛瘀、软坚散结之效[8-9]。甲炎康泰治疗甲状腺疾病临床疗效明确,对患者急躁、易怒、乏力、心悸等症状改善明显,组方中药活性成分多、作用靶点广泛,作用机制值得深入研究。本研究在课题组前期基础上,结合高特异性、高通量的抗体芯片技术,检测甲炎康泰颗粒剂对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠(experimental autoimmune thyroiditis,EAT)免疫相关细胞因子的影响,补充甲炎康泰改善自身免疫性甲状腺炎作用机制,为其临床应用提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

30只5周龄SPF级雌性Lewis大鼠,体重约150 g,购买于北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2016-0006】。大鼠饲养于北京中医药大学实验动物中心SPF级动物房【SYXK(京)2020-0033】。饲养环境:温度(22±3)℃、相对湿度55%±10%,12 h光照/12 h黑暗交替循环。本实验严格执行中华人民共和国国家标准GB14925-2001并通过北京中医药大学动物实验伦理委员会审查批准(BUCM-4-202922901-4148)。

1.1.2 主要试剂与仪器

甲状腺球蛋白(美国Sigma,T1126-1G)、完全弗氏佐剂(美国Sigma,F5881),不完全弗氏全佐剂(美国Sigma,F5506),碘化钠(上海源叶生物,S30233),甲状腺球蛋白ELISA试剂盒(武汉华美生物,CSB-E11199r),HiScriptⅢRT SuperMix(南京诺唯赞生物,R323-01),Taq Pro Universal SYBR Qpcr Master Mix(南京诺唯赞生物,Q712-02),大鼠抗体芯片试剂盒(美国Raybiotech,QAR-CYT-3、QARCYT-4),甲炎康泰颗粒剂(北京康仁堂药业,批号:DRUG-N202103171200585990)。

光学显微镜(Olympus,BX53,日本),酶标仪-多功能检测系统(Promega,GloMax-Multi,美国),电子天平(Mettler-Toledo,ML54/02,中国),离心机(Sigma,3K15,德国),实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,7500 Real time PCR System,美国),芯片扫描仪(Innopsys,InnoScan 300,法国)。

1.2 方法

1.2.1 造模、分组及给药

大鼠适应性喂养1周后,按体重随机分为正常组10只、造模组20只。正常组大鼠自由摄食饮水。造模组大鼠饮用含碘水(含碘化钠0.064%),第3周初次免疫,以完全弗式佐剂1∶1乳化甲状腺球蛋白(终浓度0.05%),在大鼠颈后部、左右下腹部皮下注射混合乳化剂每只0.2 mL,间隔2 d先后注射2次。第4～7周强化免疫,以不完全弗式佐剂1∶1乳化甲状腺球蛋白(终浓度0.05%),在相同部位皮下注射混合乳化剂每只0.2 mL,每周1次,共4次。

第7周末,检测血清甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,TGAb)水平,鉴定是否成模。将造模成功大鼠按抗体水平随机分为模型组和给药组。给药组灌胃甲炎康泰溶液,灌胃剂量2.834 g/(kg·d)(参照人和动物体表面积等效剂量换算,并结合本课题组前期多次实验确定[10-11]),每日1次;正常组和模型组用等容量去离子水灌胃,灌胃容量10 mL/kg,每日1次,连续给药8周。

1.2.2 甲状腺抗体水平检测

大鼠采用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)麻醉后经腹主动脉取血,3000 rpm离心10 min后分离上层血清。ELISA法检测血清TPOAb、TGAb水平:在已包被的酶标板每孔加入生物素标志物反应液50 μL,再分别在标准品孔、样品孔中依次分别加入标准品S1～S6、待测血清样品50μL,37℃孵育1 h后充分洗涤;在每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素反应液50μL,37℃孵育30 min后充分洗涤;在每孔加入发光底物A和发光底物B各50μL,37℃避光孵育15 min后,在每孔加入反应终止液50μL。酶标仪测定光度值(OD450),用标准品绘制标准曲线,并计算各血清样品浓度。

1.2.3 甲状腺形态观察

每组各取3只大鼠,采用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)麻醉后沿腹中线向上,剖开胸腔,小心剥离心包膜及周围组织,充分暴露心脏通过心脏灌注固定:注射针头沿心尖插入升主动脉方向,剪开右心耳,依次向大鼠体内注入足量生理盐水、4%多聚甲醛。固定后于冰上快速剥取大鼠甲状腺,置于4%多聚甲醛溶液,制作石蜡切片,HE染色,显微镜下观察甲状腺形态改变。

1.2.4 靶点基因表达水平检测

实时荧光定量检测白介素4(interleukin-4,IL-4)、干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白 介 素 17(interleukin-17,IL-17)、趋化因子CC亚群配体3(CC motif chemokine ligand 3,CCL3)、趋化因子CX3C亚群配体1(C-X3-C motif chemokine ligand 1,CX3CL1)基因表达。TRIzol法提取大鼠甲状腺RNA:向甲状腺组织加入适量TRIzol,12 000 rpm 4℃离心5 min取上清,加氯仿震荡,离心后取上清,加异丙醇沉淀RNA,离心后取上清,加无水乙醇洗脱,得到RNA沉淀。使用HiScriptⅢRT SuperMix试剂盒配制反转录体系,反应条件为:42℃2 min去除DNA;37℃15 min→85℃5 s,冷却后得到cDNA。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行qPCR扩增,反应条件为:95℃30 s预变性;95℃10 s→60℃30 s,40循环;95℃15 s→60℃60 s→95℃15 s检测融解曲线。待测基因相对表达量以2-ΔΔCt表示。(待测基因上下游引物序列如表1所示)。

表1 待测基因上下游引物序列Table 1 Forward and reverse primers of target genes

1.2.5 靶点蛋白表达水平检测

采用抗体芯片检测蛋白表达水平:试剂盒室温平衡30 min,抗体芯片超净台中干燥2 h。按试剂盒说明书梯度稀释混合细胞因子标准品。向芯片每孔加入100μL封闭液,室温摇床封闭1 h。向每孔加入60μL标准液或待测样品,4℃摇床孵育过夜。次日洗板,每孔加入150μL洗液Ⅰ清洗每次5 min、进行5次;再加入150μL洗液Ⅱ清洗每次5 min、进行5次。洗净后向每孔加入80μL混合细胞因子抗体,室温摇床孵育2 h。再次分别用洗液Ⅰ、洗液Ⅱ洗板。洗净后向每孔加入80μL Cy3-链霉亲和素,室温避光摇床孵育1 h。再次先后用洗液Ⅰ、洗液Ⅱ充分洗涤并干燥芯片。采用芯片扫描仪扫描,扫描波长532 nm,分辨率10μm。通过Raybiotech软件提取数据,计算各细胞因子相对表达量并绘制聚类热图。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0(中文版)软件进行数据统计。符合正态分布的定量资料以平均值±标准差(±s)形式示出,多组资料之间比较采用单因素方差分析;非正态分布的定量资料和计数资料采用非参数检验。P＜0.05为组间差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺抗体水平

如表2所示,模型组大鼠血清TPOAb、TGAb抗体表达量较正常组显著升高(P＜0.01);给药组大鼠血清TPOAb、TGAb抗体表达量较模型组显著降低(P＜0.05)。

表2 大鼠血清TPOAb、TGAb抗体水平Table 2 Expressions of serum TPOAb and TGAb

2.2 甲状腺形态变化

如图1所示,正常组大鼠甲状腺滤泡结构正常,滤泡腔内红色胶质饱满、分布均匀,滤泡上皮细胞排列紧密。与正常组相比,模型组大鼠甲状腺滤泡细胞结构存在不同程度破坏,滤泡上皮细胞排列不紧密,滤泡体积变小、数量增多、滤泡腔皱缩,腔内胶质减少,滤泡间质存在大量淋巴细胞浸润。与模型组相比,给药组大鼠甲状腺滤泡细胞结构破坏程度较轻,滤泡腔皱缩、胶质减少、滤泡间质淋巴细胞浸润等情况有所缓解。

图1 大鼠甲状腺形态Figure 1 Morphology of thyroids of rats

2.3 靶点基因水平

如图2所示,模型组IFN-γ、TNF-α、IL-17、CCL3、CX3CL1基因相对表达量较正常组显著升高(P＜0.05);给 药 组IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-17、CCL3、CX3CL1基因表达量较模型组显著降低(P＜0.05)。

图2 大鼠IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-17、CCL3、CX3CL1基因相对表达量Figure 2 Gene expressions of IL-4,IFN-γ,TNF-α,IL-17,CCL3 and CX3CL1

2.4 靶点蛋白水平和聚类分析

如图3所示,对以上细胞因子绘制聚类热图,正常组与模型组、给药组两两之间细胞因子差异显著,聚类较好。如图4所示,模型组IL-17、CCL3、CX3CL1蛋白表达量较正常组显著升高(P＜0.01);给药组IL-4、IFN-γ、TNF-α、CCL3、CX3CL1蛋白表达量较模型组显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。

图3 大鼠差异表达细胞因子热图Figure 3 Clustering heatmaps of differential-expressed cytokines

图4 大鼠IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-17、CCL3、CX3CL1表达量Figure 4 Expressions of IL-4,IFN-γ,TNF-α,IL-17,CCL3 and CX3CL1

3 讨论

在中医药理论中,自身免疫性甲状腺疾病属于“瘿病”“瘿瘤”范畴,病位主要在颈前甲状腺,与肝、脾密切相关,基本病机为气滞、血瘀、痰凝壅结颈前。其发病与情志内伤密切相关。长期郁怒忧思、情志不遂,导致肝气郁结,或痰湿凝聚,或气滞血瘀,或气郁化火,发为瘿病[12]。中医药在治疗瘿病方面历史悠久,经验丰富,是单独使用中药治疗有效的优势病种,在降低抗体水平、改善不适症状、缩短病程等方面有一定优势。其中,疏肝解郁、化痰祛瘀、软坚散结是治疗瘿病重要方法。

甲炎康泰是刘铜华教授总结多年临床诊疗经验提出的治疗甲状腺疾病经验方,为北京中医药大学东方医院院内制剂,广泛用于肝郁气滞、痰凝血瘀型甲状腺疾病的治疗。方中柴胡、郁金为君药,共奏疏肝解郁之效;夏枯草、穿山龙为臣药,共助君药以清肝散结、化瘀通络;浙贝母、玄参、山慈菇、黄芪为佐药,一则清热解毒、化痰除湿、软坚散结,一则补脾益气,祛邪而不伤正;乌梅为使药,收敛生津,以防诸药苦寒伤阴。诸药相合,从肝论治,共奏疏肝解郁、化痰祛瘀、软坚散结之功。临床试验证实甲炎康泰治疗桥本氏甲状腺炎证属肝郁气滞、痰凝血瘀者,可显著改善急躁易怒、神疲乏力、太息心悸等症状,降低抗体水平,缓解甲状腺肿大[8-9,13]。

自身免疫性甲状腺炎发生时,T、B淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞等浸润甲状腺,诱发免疫紊乱。本实验采用甲状腺球蛋白免疫佐剂联合口服碘剂诱导作为体内模型,该模型是研究自身免疫性甲状腺炎的经典模型,通过外源性甲状腺球蛋白触发大鼠产生免疫反应,通过免疫佐剂打破免疫耐受稳态,较好地模拟了甲状腺肿大、甲状腺滤泡破坏及功能障碍、淋巴细胞浸润等病理特点,具有可重复性好、成模率高等优势[7,14]。在此模型上发现甲炎康泰颗粒剂(2.834 g/(kg·d))可降低甲状腺抗体水平,缓解甲状腺滤泡结构破坏、胶质减少、淋巴细胞浸润等病理改变,从而减轻自身免疫性甲状腺炎甲状腺损伤。

研究证实自身免疫性甲状腺疾病存在淋巴细胞免疫紊乱和功能障碍,当甲状腺炎发生时,B淋巴细胞产生大量抗甲状腺抗体,产生细胞毒作用,造成甲状腺损害,Th1、Th2、Th17等大量淋巴细胞浸润并破坏甲状腺正常结构,分泌IL-1β、IL-4、IFN-γ、IL-17等多种效应因子进一步放大免疫效应,导致免疫紊乱,加剧甲状腺结构和功能的破坏[15]。促炎性因子IFN-γ和IL-4分别是诱导Th1、Th2细胞介导免疫应答的关键指示信号,并可调控TNF-α、IFN-γ、IL-6、PGE2等炎症因子释放,诱导淋巴细胞浸润甲状腺,并放大免疫反应效应[16-18]。IL-17是Th17细胞效应因子,可招募中性粒细胞,刺激多种促炎性因子分泌,加速自身免疫性甲状腺炎进展[19]。很多趋化因子与自身免疫性甲状腺疾病相关,CCL3与甲状腺免疫密切相关,可反映甲状腺免疫紊乱早期病变[20],CX3CL1是唯一一种细胞内化的趋化因子,甲状腺激素可通过驱动整合素αvβ3内化而调节CX3CL1及其受体CX3CR1表达,诱导白细胞趋化和黏附,诱导CD8+淋巴细胞、NK细胞迁移和黏附,导致甲状腺免疫紊乱[21-22]。本实验结合抗体芯片检测技术同时检测多种细胞因子,该技术具有灵敏性高、特异性强、准确性好等优势,在自身免疫性疾病、心血管疾病、肿瘤等学科新药研发、靶点筛选、药物机制探索领域发挥重要作用[23-24]。通过模型组和正常组比较发现IL-4、IL-17、IFN-γ、TNF-α、CCL3、CX3CL1等免疫相关细胞因子与自身免疫性甲状腺炎发病相关,与既往研究相一致。甲炎康泰颗粒剂可通过调节这些免疫相关细胞因子表达而减轻甲状腺损伤,从而发挥治疗作用。

综上,本实验在EAT大鼠模型上验证了甲炎康泰颗粒剂可调节免疫相关细胞因子表达水平,减轻自身免疫性甲状腺炎的甲状腺损伤,初步阐明了甲炎康泰干预自身免疫性甲状腺炎机制,为其临床应用提供了实验证据,后续实验需对相关靶点因子及上下游通路做进一步深入验证。