人脐带间充质干细胞对自然衰老大鼠海马自噬水平的影响

张茹鑫，李承罡，杜若琛，原一桐，李宵，赵碧春，张玉娟，王春芳∗

(1.山西医科大学实验动物中心，太原 030001；2.山西医科大学第二医院，太原 030001)

随着全球人口老龄化的进程日益加快，衰老已经成为国内外神经科学与衰老生物学研究的热点问题，而脑是受衰老影响最大的器官之一，脑的衰老会引起大脑内微环境的改变，主要表现为树突棘密度的降低、树突数量的减少以及突出后模致密物的变薄，这些被认为是衰老时记忆力减退、认知功能衰退的原因。研究显示，在自然衰老的机体中，ATG蛋白或自噬诱导所需要的其他蛋白如Sirtuin1表达下调[1-2]。有研究显示，通过对酿酒酵母菌中年龄老化因子的无偏筛选，发现了多个具有自噬缺陷的短寿突变体(包括117个短寿突变体中的10个ATG突变)[3]。在阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)和亨廷顿病中，自噬有神经保护的作用[1]。在正常人类衰老大脑中，自噬相关基因5(autophagy-related5，Atg5)，自噬相关基因 7(autophagy-related7，Atg7)和 Beclin 1表达下调，与年龄相关的骨关节炎中UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1，ULK1)、Beclin1和微管相关蛋白1轻链3 II/I(microtubule-associated protein1 light chain 3 II/I，LC3II/I)表达也下调[4-5]。这些发现表明，自噬的减弱可能是造成衰老表型的一种原因，因此提高自噬是抗衰老的有效手段。

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)自发现以来，就因其具有高度的自我更新和多向分化潜能而备受关注，已经被用于多种疾病的基础研究和临床试验研究。文献报道，hUCMSCs通过改善突触可塑性和内源性神经发生恢复了老年小鼠海马依赖性学习记忆能力[6]。有研究显示hUCMSCs-exo可以诱导自噬并且穿过血脑屏障到达灰质，减轻帕金森(Parkinson’s disease，PD)大鼠模型的不对称旋转缺陷[7]。在膀胱肿瘤中通过AKT/mTOR信号通路，使Atg5、Atg7和Beclin1上调并使磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(pmTOR)下调增强膀胱肿瘤自噬性[8]。在器官退行性病变中，移植人脐带间充质干细胞后使各脏器中自噬相关蛋白 Beclin1、LC3II/I高表达，证明hUCMSCs通过调节自噬提高机体抗氧化应激的能力来延缓衰老[9]。但hUCMSCs对于衰老进程中引起的脑部自噬水平紊乱是否有调节作用，以及是否可以通过移植来调控自噬的发生改善认知功能方面的报道较少。因此，本研究目的是评估静脉注射hUCMSCs对自然衰老引起的认知障碍的作用及调节脑部海马区自噬水平的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

50只24月龄清洁级雄性SD大鼠，体重约为800 g；15只3月龄清洁级雄性SD大鼠，体重约为300 g。购于山西医科大学实验动物中心【SCXK(晋)2019-0005】，饲养于山西医科大学实验动物中心屏障环境中【SYXK(晋)2019-0007】。饲养环境：昼夜各半循环照明，湿度恒定，温度控制在22～25℃。所有操作均符合实验大鼠的饲养过程和其他实验操作均符合实验动物伦理学要求(审批号：SYDL2020004)以及中华人民共和国《实验动物管理条例》。

1.1.2 主要试剂与仪器

Anti-LC3II/I Rabbit pAb (Wanleibio，WL01506)， Anti-P62 RabbitpAb(Wanleibio，WL02385)， Anti-Beclin1 Rabbit pAb(Wanleibio，WL02508)，Anti- β-actin Rabbit pAb(Wanleibio，WL01372)，HRP Conjugated AffiniPure Goat Antirabbit/mouse IgG(BOSTER，BA1054)，PageRulerTMPrestained Protein Ladder(Thermo ScientificTM，26616)，Beyo ECL Star(Beyotime，P0018AFT)，HE染色试剂盒(Solarbio，G1120)，通用型组织固定液(Servicebio，G1101)。

Morris水迷宫和动物运动轨迹跟踪系统(Noldus，荷兰)，Y迷宫实验箱(自制)，新物体识别实验箱(自制)，细胞培养箱(Heal Force，HF240，中国)，石蜡切片机(Leica RM 2245，德国)，荧光显微镜(OLYMPUS，日本)，电泳仪(Bio-Rad，美国)，转膜仪(Bio-Rad，美国)，高灵敏度化学发光成像系统(Bio-Rad，美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及实验干预

经过行为学筛选出现学习认知衰退的24月龄大鼠30只，再将其随机分为：细胞移植组(H组)(15只)，生理盐水组(C组)(15只)。3月龄大鼠分为：正常年轻组(N组)(15只)。H组：尾静脉注射hUCMSCs细胞混悬液500 μL，剂量为每只2×106个。C组和N组分别尾静脉注射NaCl，连续4次。细胞移植组所有大鼠均无脱失，注射细胞后无免疫排斥反应和急性毒性反应，注射后1个月时间内所有SD大鼠也均无其他异常现象。

1.2.2 细胞培养

脐带组织来源于山西省儿童医院，经伦理委员会批准并经过产妇及家属知情同意。细胞培养方法参照[10]，将第3～4代细胞用0.25%胰酶/EDTA消化后，再用0.9%的生理盐水漂洗，重悬细胞并调整密度为每毫升4×106个。

1.2.3 新物体识别

细胞注射结束1周后，开始新物体识别实验。实验方法参照[11]新物体识别概率视为新物体探索次数/总探索次数 ×100%表示[12]，新物体辨别系数视为(新物体探索时间 -旧物体探索时间)/(新物体探索时间 +旧物体探索时间)表示[13]。数据采集处理由ANY-Maze软件(Stoeling，美国)完成。

1.2.4 Y迷宫

新物体识别实验结束1 d后，开始Y迷宫实验。自发交替行为测试：用于测试大鼠短期工作记忆能力。实验开始时，将大鼠放入Y迷宫任意臂末端，任其自由探究8 min，摄像系统记录动物的活动，记录分析大鼠的进入各臂的顺序和总次数，并计算交替正确率。交替正确率＝进臂正确的次数/(进臂总次数-2)×100%[14]。

新异臂探索实验：用于检测大鼠的空间探索能力，分为两部分：训练期，用挡板将新异臂隔开，将大鼠放入剩余某臂中，并使其自由活动10 min，24 h后进行测试部分。测试期，取出挡板，将大鼠随机放入一臂中，使其在实验箱内活动5 min。录像并记录每只大鼠进入新异臂的次数。数据采集处理由ANY-Maze软件(Stoeling，美国)完成。

1.2.5 Morris水迷宫

Y迷宫结束1 d后，开始Morris水迷宫实验。用来测试大鼠的长期工作记忆能力。实验方法参照[15]，数据采集处理由Ethovision 3.0软件(Noldus Information Technology，荷兰)完成。

1.2.6 HE染色

大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠(50 mg/kg)，完全麻醉后暴露心脏，先用180 mL 0.9%无菌生理盐水冲洗，然后180 mL 4%多聚甲醛灌注。待灌注成功后，分离出大脑，置于4%多聚甲醛内常温固定24 h，制作石蜡切片，然后进行HE染色，最后中性树脂封片后镜下观察并拍片记录。通过HE染色观察海马内部细胞的结构变化。

1.2.7 Western Blot

将SD大鼠麻醉后快速断头，冰上取出大鼠新鲜海马组织，-80℃冷冻保存。取出加入组织裂解液冰上研磨、低温离心提取总蛋白。利用BCA法检测蛋白浓度，各样本内蛋白含量根据标准曲线计算。每组取40 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，再将蛋白转移至PVDF膜上，封闭用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液，室温摇床封闭1.5 h，将封闭好的PVDF膜浸泡在以TBST稀释的LC3II/I(1∶750)，P62(1 ∶1000)，Beclin1(1 ∶750)，β-actin(1∶1000)一抗中，4℃条件下孵育过夜，洗涤后浸泡在以TBST(1∶10000)稀释的二抗中，室温摇床孵育2 h。最后将PVDF膜放至凝胶成像仪上，加入ECL化学发光剂显色成像并保存。条带的灰度值采用Image Lab软件分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 hUCMSCs的形态观察

原代hUCMSCs培养14 d后贴壁生长，第3代细胞生长状态良好，呈长梭形漩涡状，典型集落生长(图1A，1B)，细胞融合至80～90%时用于实验。

2.2 hUCMSCs改善衰老大鼠在新物体识别实验中的学习记忆能力

H组大鼠和N组大鼠新物体识别率和分辨系数显著高于C组(P＜0.01)，H组和N组间无显著差异(图 2A，2B)。

2.3 hUCMSCs改善衰老大鼠在Y迷宫实验中的短期工作记忆和空间探索能力

H组和N组自发交替行为显著高于C组(P＜0.05)，H组和N组间无显著差异(图3A)。H组和N组进入新异臂的次数显著高于C组(P＜0.05)，H组和N组间无显著差异(图3B)。

2.4 hUCMSCs改善衰老大鼠在经典水迷宫实验中的长期工作记忆和空间探索能力

H组和N组大鼠随着训练时间延长，逃避潜伏期显著短于C组大鼠，在训练的第4天差异极显著(P＜0.01)；H组和N组无差异(图4A)；在第5天的空间探索实验中，游泳轨迹可看出H组和N组呈直线式搜索，C组呈曲线式搜索(图4B)；H组和N组跨越平台次数和目的象限停留时间显著大于C组(P＜0.01)(图4C、4D)；此外，各组大鼠的游泳速度没有统计学差异(图4E)。

2.5 hUCMSCs改善衰老大鼠海马CA1区和DG区神经元数量及形态

H组和N组海马CA1区细胞排列较规整，结构完好，细胞核饱满，C组CA1区神经元数量减少，排列疏松，细胞核有固缩、碎裂现象(图5A、5B、5C)。H组和N组海马DG区形态规整，神经细胞排列紧密，细胞结构完整，细胞核饱满。C组大鼠海马DG区形态不规整，细胞数量减少，细胞核固缩，碎裂严重(图 5D、5E、5F、5G、5H、5I)。

图1 光学显微镜下处于对数期生长的第3代hUCMSCs细胞形态Figure 1 Morphology of the third generation hUCMSCs growing in log phase under light microscope

图2 新物体识别实验(，n＝10)Note.Compared with group C，∗∗P＜ 0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Novel object recognition test(，n＝10)

图3 Y迷宫实验(，n＝10)Figure 3 Y Maze(，n＝10)

图4 Morris水迷宫实验(，n＝10)Note.A，B.The time and track of the rats to find the platform in the positioning cruise experiment.C，D.The number of times the rats crossed the platform in the space exploration experiment and the time they stayed in the target quadrant.E.Swimming speed of rats in water maze experiment.Figure 4 Morris water maze(，n＝10)

2.6 hUCMSCs干预后增强了衰老大鼠海马中自噬相关蛋白的表达

H组和N组大鼠海马中LC3Ⅱ蛋白含量较C组显著升高(P＜0.01)，LC3Ⅰ蛋白含量较C组显著降低(P＜ 0.05，P＜ 0.01)，LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值较C 组显著升高(P＜ 0.05，P＜ 0.01)(图6A、6C)，H 组和N 组大鼠海马中P62蛋白含量较C组显著降低，Beclin1蛋白含量较C组显著升高(P＜0.01)(图6A、6B)。

图5 各组海马组织HE染色(，n＝3)Note.Black arrow for nuclear shrinkage，fragmentation.Figure 5 HE staining of hippocampal tissues of each group(，n＝3)

图6 蛋白条带和相对含量(，n＝3)Note.A.Western Blot protein bands of Beclin1，P62and LC3II/I.B，C.Compared with group C，∗P＜ 0.05，∗∗P＜ 0.01.Figure 6 Protein bands and relative protein content(，n＝3)

3 讨论

衰老是随着年龄的增长，机体逐渐出现生物学损伤的过程，有研究表明，中枢神经系统最易受到衰老影响，常常伴随导致认知功能下降甚至神经退行性疾病的发生，对老年人的生活造成了巨大的影响，随着全球老龄化人口日渐增多，这一问题变得更加严峻。hUCMSCs作为一种易获取、无伦理争议和免疫排斥反应，且具有高度自我分化及更新能力的干细胞，已经应用于很多中枢神经系统疾病的研究，能够修复神经系统的损伤和衰老过程中的导致的脑部微环境的改变[6-7，16]，大多是从DNA损伤和氧化应激等机制入手[17]，hUCMSCs对脑衰老与自噬之间的关系研究较少。因此，本文选取出现认知和学习记忆能力衰退的自然衰老大鼠为研究对象，通过移植hUCMSCs探讨其与衰老所致的认知衰退与自噬之间的关系。

考虑到实验中水迷宫雌雄鼠的体力和游泳速度的差异，造成实验结果出现明显的两极分化[18]且加入性别差异后不符合实验设计单一变量的原则，除此以外类似研究多数也用单一雄性大鼠作为实验对象[19-20]，因此在本实验中优先选择了单一性别雄鼠作为研究对象。

据我们所知，在临床上，脑室注射经常面临着颅内感染甚至更严重的脑损伤，其移植的必要性和转分化的频率仍有争议。相比之下，静脉移植MSCs较为安全，这一点是普遍比较认可的。最近一项研究也证明了这种方式的安全性[21]，与在中枢神经系统直接给药有明显的临床优势并且更容易接受[22]。因此我们在本实验中采取了静脉注射这种侵入性较小的方式，对自然衰老出现认知障碍的动物模型进行慢性治疗，移植的剂量与时间是通过预实验来确定的。

除此之外，有研究表明静脉移植MSCs在缺血性脑卒中、亨廷顿病[23]和AD[24-25]等模型中均可迁移并定位到大脑区域[26-27]，但只有一小部分细胞会到达炎症组织，这表明它们的治疗作用可能是由于其分泌的具有免疫调节和营养活性的生物活性分子起作用[28-29]，有鉴于此，先前的研究表明，在外伤性脑损伤中，MSCs通过与非神经系统器官(如脾)相互作用而起到神经保护作用[30]。考虑到这些因素，我们认为间充质干细胞的治疗效果可能是由分泌的生物活性分子或其他免疫细胞介导的。

Beclin1、LC3和P62参与了自噬发生的起始、延长、成熟和降解的整个过程，是判断自噬过程的关键指标。Beclin1是自噬起始的重要组成部分，其与PI3K结合形成复合物，招募胞浆中的自噬相关的蛋白，形成完整自噬体[31]。LC3是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，一般以LC3I和LC3II两种形式出现[32]，在Atg4的作用下，LC3I经过剪切和泛素化加工修饰，与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺相结合，形成LC3II。一般以LC3II与LC3I的比值来评估自噬水平，作为反映自噬活性高低的一个有效指标[33-34]。p62蛋白作为细胞自噬调控过程中的一种可选择底物，其累积提示自噬能力衰退，而当P62被降解时表示自噬被激活，因此P62与自噬水平负相关[35]，本研究发现与对照组相比移植hUCMSCs的自然衰老大鼠的海马组织中Beclin1和LC3II/I的比值表达量显著增加，P62蛋白表达显著下降，表示hUCMSCs干预诱导Beclin1合成增加，激活自噬的起始阶段。LC3II合成增加，参与自噬溶酶体膜的延伸，直到自噬溶酶体形成，并在后期与P62相互作用后使P62在溶酶体降解，形成完整的自噬流。证明hUCMSCs干预后增强了衰老大鼠海马自噬水平，改善了随着年龄增加导致的自噬缺陷。

本课题还发现在Morris水迷宫实验中，移植hUCMSCs后的大鼠在定位航巡实验中第2、3、4天的逃避潜伏期明显低于对照生理盐水组，并且与3月龄大鼠无差异(未给数据)；在撤掉水下隐藏平台后，细胞移植组经过原平台位置的次数以及在目的象限停留的时间明显高于对照生理盐水组，说明移植hUCMSCs后，自然衰老大鼠的长期工作记忆和空间探索能力的水平有所提高。Y迷宫实验用来检测大鼠的空间工作记忆及片段式学习记忆，实验发现移植hUCMSCs组大鼠与生理盐水组相比自发交替行为正确率和进入新异臂的次数显著增加。新物体识别实验中，细胞移植组大鼠探索新物体的次数显著高于生理盐水组大鼠，以上行为学实验表明，hUCMSCs对自然衰老大鼠的片段式记忆，长期工作记忆和空间探索能力均有所提高。在本实验中发现干细胞移植可改善自然衰老大鼠短期内的认知衰退，长期的效果还有待探索。

综上所述，静脉注射间充质干细胞是一种很有前途的治疗方法，其对改善脑衰老引起的脑部神经元丢失，自噬减弱以及对工作记忆和对物体及方位的学习记忆衰退起着重要的作用。MSCs治疗神经退行性病变仍处于早期研究阶段，在今后的课题研究中，应致力于解开这种治疗的具体机制，将从hUCMSCs如何具体影响衰老大鼠海马的自噬水平以及能否长期改善脑衰老引起的认知方面的衰退进行更加深入的研究。