连续性血液透析滤过联合依那普利对急性重症胰腺炎大鼠肾功能及肠功能的改善作用

刘倩，鲁华，郭更新，刘静，李娜

(1.邢台市人民医院肾内科，河北 邢台 054001；2.邢台市人民医院产科，河北邢台 054001)

急性重症胰腺炎具有发病急、进展快、病情重的临床特点，常伴有多器官功能的改变，如肺、肾、肠道等，急性重症胰腺炎引起的多器官功能衰竭是急性重症胰腺炎患者死亡的主要原因[1-2]。因此，及早的防治器官衰竭有重要的临床意义。目前，针对急性重症胰腺炎合并多器官功能障碍尚无特效疗法。王锋等[3]研究发现，连续性血液透析滤过能够有效改善急性重症胰腺炎大鼠的肠功能障碍。依那普利是常用的降压药，对于肾有一定的保护作用[4]。但连续性血液透析滤过联合依那普利用于急性重症胰腺炎的研究较少，依那普利(enalapril)是属于血管紧张素转换酶抑制类降压药，具有扩张血管作用，主要用于高血压、心理衰竭等疾病[5]。故本研究联合连续性血液透析滤过和依那普利，探讨其对急性重症胰腺炎大鼠肾功能和肠功能的影响，并初步分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

60只6～8周龄清洁级雄性的SD大鼠，体重200～240 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号【SCXK(京)2019-0002】，动物实验室的使用许可证号【SYXK(冀)2019-0003】，实验动物福利伦理(审批号2019A005号)。饲养条件：温度20～24℃，湿度40%～60%，每12 h昼夜交错。

1.1.2 主要试剂与仪器

依那普利，纯度为97%，购自上海源叶生物科技有限公司；苏木素、伊红购自上海恒斐生物科技有限公司；ET试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司；ELISA试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司；FITC-Dextran购自美国MCE公司；BCA试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；蛋白一抗购自美国 Life Technologies公司；标记二抗辣根过氧化物酶兔抗蛋白购自上海优予生物科技有限公司。iMark酶标仪购自美国Bio-Rad，F-4600型荧光分光光度计购自日本日立。

1.2 方法

1.2.1 动物模型

腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，于上腹部正中作切口，小心分离胆胰管，夹闭肝门处胰胆管，由十二指肠前壁进针，向胰胆管注入3%牛磺胆酸钠(流速为0.1 mL/kg)。待见胰腺出现水肿出血时，提示急性重症胰腺炎大鼠模型复制成功[6]。松开血管夹，逐层缝合、关腹。术后注意保温，大鼠均自由摄食饮水。

1.2.2 分组及干预

60只SD大鼠随机分为5组：对照组、模型组、连续性血液透析滤过组、依那普利组及连续性血液透析滤过联合依那普利组，除对照组外均采用牛黄胆酸钠诱导急性重症胰腺炎大鼠模型，对照组处理：手术后进翻动肠道和胆胰管，注射等量生理盐水。术前7 d灌胃10 mg/(kg·d)的依那普利，每天1次。建模成功后立即连续性血液透析滤过4 h，具体操作如下：(1)腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，后续操作中每1～2 h追加剂量(首次剂量的1/4)，维持麻醉状态；(2)建立静脉通路，于颈部作切口，分离右侧颈动脉，结扎颈动脉远心端，并临时夹闭近心端，缓慢插入PE50导管，连接三通阀后松开动脉夹，缓慢注入肝素生理盐水(预防凝血)，参照上述方法分离左侧颈静脉插管；(3)连续性血液透析滤过，以右侧颈动脉为体外循环的流出通路，左侧颈静脉为流入通路，连接瑞典金宝AK100透析机，参数设置：置换液流速0.4～0.5 mL/h，血流速度0.8～1.0 mL/min，过程中予以肝素抗凝。对照组和模型组分别皮下注射生理盐水，并以等量生理盐水灌胃。

1.2.3 观察指标

透析处理后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，取腹主动脉血4～5 mL，分别置于EDTA抗凝管和普通采血管中；采集大鼠胰腺、肾及肠粘膜组织，部分固定于4%甲醛中，剩余冻存于液氮罐中。

(1)组织HE染色

于4%甲醛中取出大鼠组织，脱水后行常规石蜡包埋，切片厚度为4 μm，进行苏木素-伊红染色后，光镜下观察大鼠胰腺、肾及肠粘膜组织的病理变化。参照Shmidt评分[7]，以水肿、坏死、出血及炎症细胞浸润评价胰腺组织损伤程度，各项评分0～4分，最终评分为各项目评分之和的四分之一。参照肾病理损害标准进行评估[8]，具体为：0分为肾小球、肾小管结构正常；1分为肾小球结构正常，肾小管上皮浊肿；2分为肾小球瘀血或缺血性改变，肾小管上皮变性，细胞界限模糊，管腔出现变窄、闭塞或水肿；3分为在2分的基础上，成片出现肾小管上皮坏死。参照Chiu肠粘膜损伤评分[9]，具体为：0分为肠粘膜绒毛正常；1分为绒毛顶端出现间隙，伴有充血；2分为上皮下间隙扩大，伴有水肿、乳糜管扩张等；3分为水肿明显，上皮细胞变性、坏死或少数绒毛脱落；4分为上皮细胞变性、坏死、脱落或部分绒毛脱落，固有层裸露，血管扩张、充血；5分为绒毛脱落、固有层崩解，出血或形成溃疡。

(2)血指标检测

EDTA抗凝管中血液经离心沉淀后，取上层血浆检测内毒素(ET)、D-乳酸(D-LC)的含量；普通采血管中血液经离心沉淀后，取上层血清检测淀粉酶(AMY)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的含量。ET检测为终点显色法鲎试剂[10]，梯度配制ET标准溶液，取无热原试管加入100 μL ET检查用水、标准溶液和样本，再混入100 μL鲎试剂，37℃孵育 1 min，加入100 μL显色基质，37℃孵育2 min，分别加入500 μL偶氮化试剂，混匀后静置5 min，于545 nm处检测各孔吸光值，绘制标准品浓度-吸光值曲线，计算ET的含量。其余指标检测均为ELISA法[11]，梯度配制标准溶液，将标准溶液和样本(每孔100 μL)加入孔板中，封孔后37℃下孵育90 min，加入生物素化抗体工作液(每孔100 μL)，封孔后37℃下孵育60 min，加入酶结合物工作液(每孔100 μL)，封孔后37℃下孵育 30 min，加入显色剂(每孔 100 μL)，避光处37℃下孵育 10 min，加入终止液(每孔 100 μL)，于450 nm处检测各孔吸光值，绘制标准品浓度-吸光值曲线，计算相应因子的含量。

(3)肠道粘膜通透性检测

采用改良Chen法[12]，肠腔注入FITC-Dextran溶液(25 mg/mL)0.2 mL，灌注30 min后取门静脉血100 μL，加入 Tris缓冲液补至2 mL，以 4230 r/min 离心10 min，取上清液应用荧光分光光度计检测吸光值，绘制标准品浓度-吸光值曲线，计算 FITCDextran的含量。

(4)蛋白的检测

取适量组织(约200 mg)置于新鲜、预冷的蛋白裂解液中匀浆，冰上裂解40 min；以12 000 r/min离心10 min，分离上清液，按1：50配制BCA试剂盒中A、B工作液，并梯度稀释标准品蛋白液，于96孔板中分别添加标准品蛋白液、样品(每孔20 μL)，再快速混入180 μL工作液，置于37℃下孵育30 min，应用酶标仪在570 nm处检测各孔吸光值，绘制标准品浓度-吸光值曲线，计算样品蛋白浓度；配制10%SDS-PAGE凝胶，点样50 μg变性蛋白在110 V电压(约1.5 h)下进行电泳；待蛋白完全分离时，以300 mA恒定电流电转100 min，将凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜；取出PVDF膜置于封闭液中，室温下孵育2 h；取出PVDF膜清洗后，加入一抗蛋白，4℃下孵育过夜；取出PVDF膜清洗后，加入标记二抗辣根过氧化物酶兔抗蛋白，37℃下孵育1 h；最后滴加化学发光剂进行显影[13]。以β肌动蛋白(β-actin)为内参，半定量分析肾及肠道中α血管平滑肌肌动蛋白(α-Vascular smooth muscle actin，α-SMA)、高迁移率族蛋白 B1(high mobility groupbox protein 1，HMGB1)、E钙黏素(E-cadherin)及闭合蛋白(occludin)的表达。

1.3 统计学分析

采取软件SPSS 18.0对数据进行统计学处理，数据以平均值±标准差()表示，采用Students t检验或 ANOVA分析，P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠胰腺、肾和肠粘膜组织病理改变

如图1，对照组胰腺、肾和肠粘膜组织结构清晰，未见损伤。模型组胰腺组织结构紊乱，间质水肿、出血明显，大量细胞坏死和炎性浸润；肾组织出现不用程度的肾小管上皮水肿，肾小球出血或缺血性改变，间质出血、水肿严重，大量上皮细胞坏死；肠粘膜上皮细胞出现坏死、脱落、水肿及充血。与对照组比较，模型组各组织病理评分显著增加(P＜0.05)；与模型组比较，经血液透析滤过、依那普利处理后，大鼠胰胰腺、肾和肠粘膜组织损伤明显减轻，病理评分降低，且联合处理组效果最好(P＜ 0.05)。

2.2 各组大鼠肾功能指标水平的比较

如图2，与对照组相比，模型组血清AMY、BUN、Cr水平显著上升(P＜0.05)；与模型组比，血液透析滤过、依那普利处理后显著降低AMY、BUN、Cr水平(P＜0.05)，且联合处理组下降作用更显著(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠肠功能指标水平的比较

如图3，与对照组相比，模型组血浆ET、D-LC水平显著上升(P＜0.05)；与模型组相比，血液透析滤过、依那普利处理后显著降低 ET、D-LC水平(P＜0.05)，且联合处理组下降作用更显著(P＜ 0.05)。

图1 各组大鼠胰腺、肾和肠粘膜组织病理改变Note.Compared with control group， aP＜0.05.Compared with model group， bP＜0.05.Compared with CHDF group， cP＜0.05.Compared with enalapril group， dP＜0.05.(The same in the following figures)Figure 1 Pathological changes of pancreas，kidney and intestinal mucosa tissues of rats in each group

图2 各组大鼠肾功能指标水平的比较Figure 2 Comparison on the levels of renal function indexes among all groups

图3 各组大鼠肠功能指标水平的比较Figure 3 Comparison on the levels of intestinal function indexes among all groups

2.4 各组大鼠肠粘膜屏障功能的比较

如图4，与对照组比，模型组肠道通透性明显增加(P＜0.05)；与模型组比，血液透析滤过、依那普利处理后大鼠肠道通透性明显降低(P＜0.05)，且联合处理组降低更明显(P＜0.05)。

2.5 各组大鼠相关蛋白水平的比较

如图5，与对照组比较，模型组大鼠肾组织中α-SMA的表达显著上调，E-cadherin的表达显著下调，肠组织中HMGB1的表达显著上调，Occludin的表达显著下调(P＜0.05)；与模型组相比，血液透析滤过、依那普利处理后α-SMA及HMGB1的表达显著下调，E-cadherin和Occludin的表达显著上调，且联合作用效果更好(P＜0.05)。

图4 各组大鼠肠粘膜屏障功能的比较Figure 4 Comparison of intestinal mucosal barrier function among all groups

3 讨论

本研究采用牛磺胆酸钠诱导大鼠，胰腺组织出现明显水肿、出血症状，光镜下观察到胰腺组织不同程度的充血、水肿、坏死及炎性浸润；同时，急性重症胰腺炎发生过程中，由于炎症介质“瀑布样”释放，造成“二次打击”，容易导致多器官组织损伤和功能障碍，本研究中模型大鼠肾和肠道也出现明显损伤，表明急性重症胰腺炎大鼠模型构建成功。相关动物研究证实，依那普利在多种因素引起的肾病中，对大鼠肾功能均具有保护作用，可能介导肾素-血管紧张素系统，抑制足细胞凋亡，从而减轻肾细胞损伤[14]。另外，Dahlgren等[15]研究发现，依那普利可通过抑制血管紧张素转换酶，增强大鼠肠道的防御作用。

肾是身体的主要排泄、内分泌器官，具有排泄代谢废物、调节代谢平衡及分泌激素等功能，有助于机体维持内环境的稳定[16]。研究发现，急性重症胰腺炎会引起有效循环血容量相对或绝对的不足，降低肾小球滤过率，引起血清AMY、BUN、Cr水平上升[17]。本研究发现，连续性血液透析滤过联合依那普利可明显改善模型大鼠肾组织损伤，降低血清AMY、BUN、Cr的水平，与 Chen等[18]研究结果相似。表明连续性血液透析滤过联合依那普利可有效保护模型大鼠肾功能的作用。当肾组织出现损伤时，往往伴随着肾小管间质纤维化，其中肾小管细胞上皮间质转化是其主要的生理基础；E-cadherin是细胞间维持粘附作用的主要蛋白，而α-SMA是间质细胞中的标志蛋白[19-20]。因此，肾出现损伤时，E-cadherin表达会下调，而α-SMA会上调。本研究结果显示，连续性血液透析滤过联合依那普利可显著上调模型大鼠肾中E-cadherin的表达，下调 α-SMA的表达，提示连续性血液透析滤过联合依那普利可能通过抑制肾小管上皮间质转化，减轻肾组织损伤，从而起到保护急性重症胰腺炎肾功能的作用。

图5 各组大鼠相关蛋白的表达Figure 5 Expression of related proteins in each group

研究证实，大量炎性因子的释放会损伤肠道屏障功能，增加其通透性，导致机体易继发感染[21]，因此，急性重症胰腺炎患者往往伴随着肠道功能的损害。肠道通透性增加诱发细菌易位，使细菌及其代谢产物进入体循环，进一步活化单核-巨噬细胞，再次放大炎症信号，造成全身性炎症损伤[22]。ET是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，是炎症反应的主要触发因素；而D-LC是细菌发酵的代谢产物，体内D-乳酸主要来源于肠道[23]。本研究发现，连续性血液透析滤过联合依那普利可明显改善模型大鼠肠粘膜损伤，降低大鼠肠粘膜通透性，下调血清ET、DLC的水平，与Kang等[24]研究结果相似。表明连续性血液透析滤过联合依那普利可有效保护模型大鼠肠道功能的作用。HMGB1属于炎症介质，可介导肠黏膜屏障损伤，导致其通透性增加[25]。Occludin是细胞膜紧密连接蛋白，对维持肠粘膜屏障功能有着重要的作用[26]。本研究发现，连续性血液透析滤过联合依那普利可显著上调模型大鼠肠粘膜组织中Occludin的表达，下调HMGB1的表达，提示连续性血液透析滤过联合依那普利可能通过维持肠粘膜上皮的连接，并下调炎性介质，起到保护急性重症胰腺炎肠功能的作用。

综上所述，连续性血液透析滤过联合依那普利能够有效改善急性重症胰腺炎大鼠肾功能及肠功能，可能与下调 α-SMA、HMGB1的表达，上调 E-cadherin和Occludin的表达有关，为连续性血液透析滤过联合依那普利临床用于急性重症胰腺炎的治疗提供了的理论基础。